環狀RNA (circRNA)是真核生物中共價封閉的內源性生物分子，其表達模式上具有組織特異性和細胞特異性。其生物發生受特定的順式作用元件和反式作用因子的調控，許多環狀RNA可通過充當microRNA的“海綿”或某些蛋白質的抑制劑，參與調控糖尿病、神經系統疾病、心血管疾病和癌癥等疾病的發展，因此，環狀RNA一直是科研人員關注的熱點研究之一。本期小編就和大家分享一篇套路模式比較簡單、質量層次又比較高的一篇高分文獻，一起學習其他科研人關于circRNA的研究思路。
影響因子：IF=27.4(Q1)
疾病類型：結腸直腸癌
機制方向：上皮間質轉化 (Epithelial-mesenchymal transition, EMT)
研究結論
研究者發現了一個新的環狀RNA CircPTK2，其在CRC組織中升高，并與腫瘤生長、轉移、高表達與較差的生存預后均呈正相關。本研究表明circPTK2通過結合vimentin蛋白的Ser38、Ser55和Ser82位點促進CRC細胞在體內外的EMT發生，并進一步證明了circPTK2通過下調或過表達vimentin介導CRC的調控。
此外，在患者來源的結直腸癌異種移植模型中（PDTX），尾靜脈注射特異性靶向circPTK2的shRNA可以阻斷腫瘤轉移。
研究解析
01 發現差異表達的circRNA-臨床樣本
采用circRNA芯片檢測6對結腸直腸癌臨床樣本中（癌旁VS. 癌）的circRNA的表達，篩選出30個差異circRNA(FC>2,p<0.05),并通過文獻檢測和功能分析，聚焦到目的分子circPTK2。然后于結直腸癌細胞系SW620、LOVO、SW480、HCT15（低氧和常氧條件）以及臨床組織樣本中檢測circPTK2的表達和定位。發現：circRNA在低氧誘導下出現高表達，定位未發生改變（圖1 C-E）；癌組織中較癌旁極高表達（圖1 G）。
圖1
02 差異表達驗證和生存期分析-臨床樣本
qPCR結果顯示，在不同分期的TNM樣本中，CRC組織中circPTK2的豐度明顯高于相鄰組織且在淋巴結轉移和發生遠端轉移的樣本中呈現更高的表達（圖2A-B）;RNA-ISH顯示circPTK2 在癌組織中高表達(圖 2C)，并且生信分析發現高表達circPTK2的樣本總生存率較差(圖2E)。
圖2
03 circRNA功能驗證-細胞水平和動物水平
選取結直腸癌細胞系SW620和SW480并通過對目的基因進行敲減或過表達，分別在細胞和動物水平檢測增殖和轉移的功能表型。結果表明：circPTK2的下調抑制細胞的增殖、轉移和侵襲，促進細胞凋亡；circPTK2的過表達，則促進細胞的增殖、轉移和侵襲，抑制細胞凋亡的發生，如圖3。
圖3
04 機制探究-RNA pulldown/-質譜/-WB
介于上述該基因在細胞、動物水平的功能表型，作者接下來通過RNA pulldown實驗探究circPTK2的下游靶基因或靶蛋白。結果發現，玻形蛋白VIM可以和circPTK2結合（圖4B-E），并且和circPTK2表達呈正相關（圖4A）。同時通過RNAscope 和免疫組化發現兩個基因存在共定位（圖4E）且鑒定到主要結合位點（圖4F），并在細胞和動物水平驗證了靶蛋白VIM的功能（圖4G-J）。
圖4
05 機制探究- PDTX模型
為進一步驗證circPTK2調控腫瘤細胞增殖和轉移的機制，作者設計了技術難度比較大的人源腫瘤異體移植模型(PDTX)，在該模型上驗證更貼近于臨床研究，結果更具有說服力，同時也是把整個研究層次拉到一定高度的關鍵驗證型實驗。如圖5，作者分別將處于phase I 和phase II的24個臨床病人（低表達和高表達circPTK2組）的腫瘤組織移植到小鼠皮下，經3代制備成模型；通過尾靜脈注射circPTK2 特異性shRNA 病毒（敲減或者過表達）到模型鼠中，然后檢測 VIM的表達變化（圖5 D）和細胞的增殖和轉移的變化（圖5E-G）。從結果可以看出在結直腸癌患者源性的異種腫瘤模型中，通過尾靜脈注射靶向circPTK2的shRNA可顯著抑制腫瘤轉移。
圖5
這篇文章的研究思路是比較常見的circRNA研究思路之一，作者從臨床樣本出發，通過基因芯片檢測確定了癌和癌旁中差異表達的目的基因circPTK2，然后回到不同分級的臨床樣本中做表達驗證和相關的生存預后分析，并在在細胞、動物水平驗證該circRNA的功能表型；接著作者通過RNA pulldown鑒定到了關鍵下游明星蛋白Vimentin（細胞發生上皮間質轉化 (EMT)時，該蛋白表達上調），并在細胞和動物水平進行了驗證。實驗至此，已經是比較完整的研究了，但是作者又設計了PDTX模型，利用此模型再一次驗證了上述研究結果，豐富了整個文章機制部分的證據鏈，比較全面的驗證了這一經典的研究思路：基因A（circPTK2）通過B機制（EMT）影響C疾?。ńY腸直腸癌）的D功能（增殖和轉移）。
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