大多數分子的基因表達與蛋白質豐度密切相關，但蛋白質功能和最終的生物學結果還受翻譯后修飾所調節的。盡管單細胞測序技術（scRNA-seq）已經可以深度到單細胞水平，然而蛋白質組學和磷酸蛋白質組學仍達不到?？臻g細胞分選策略在一定程度上可以克服這些限制，同時保留了組織的空間分辨率。
近期，德國海德堡德國癌癥研究中心血管腫瘤和轉移分部的研究者在Cell旗下的《Developmental Cell》（IF：10.1，中科院JCR 1區）上發表題為“A spatial vascular transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic atlas unveils an angiocrine Tie–Wnt signaling axis in the liver”的研究成果。該研究巧妙地利用空間細胞分選策略，完成了對肝小葉內皮細胞的空間轉錄組、空間蛋白組和空間蛋白磷酸組學分析，為該方向的研究提供了有效的、具有廣泛適用性的實驗設計。同時，作者也發現了一條重要的Tie-Wnt信號軸，對促進肝再生具有關鍵作用。
肝臟內皮細胞的空間多組學實驗設計和總體結果的展示
作者通過分析已發表的肝內皮細胞（L-EC）scRNA-seq中的表面分子表達情況，并通過流式細胞術分析獲得了不同L-EC亞群，且保持L-ECs空間坐標的能力，分別為門靜脈結節 [PN]、門靜脈周圍[PP]、中央周圍 [PC]和中央靜脈 [CV]。
作者在每個分群中共準備了4個生物學重復（每個生物學重復來自于30個小鼠肝內皮細胞），并將這些樣本進行了mRNA-seq、label-free蛋白質以及Label-free磷酸化蛋白質檢測?？傮w分析結果展示如下：
1. 轉錄組、蛋白組及磷酸蛋白組分別檢測到28727個基因、5015個蛋白和3447個蛋白上的19607個蛋白磷酸化位點（下圖G）。
2. 磷酸化幾乎都發生在絲氨酸（S）、蘇氨酸 (T)和酪氨酸 (Y)殘基上，占比分別為76.7%、20%和3.3%（下圖G）。通過比較四個群體的差異表達，定義了所有肝內皮細胞轉錄物、數千個蛋白質和相應的磷酸化位點的分帶模式，建立了一個全面的蛋白質表達和磷酸化的空間多組學圖。
轉錄組分區顯示了獨特的肝內皮細胞特征
轉錄組RNA seq共檢測到了超過28000個基因，在可進行定量分析的13737個基因中，共有4943個基因在表達模式上有明顯的分區特征。整體來說，對肝內皮細胞群體進行空間分類，能夠將以前單細胞測序定義的分區的空間分辨率提高了一個數量級，同樣的以分區的形式揭示了大約三分之一的可量化的肝內皮細胞轉錄物。
蛋白豐度的轉錄后調控
每個基因只有表達了合適的蛋白量才能正常發揮功能，蛋白豐度受到合成和降解的調控。一般認為轉錄組可以反映蛋白組?；谶@樣的假設，作者從結果中共找到4169個蛋白-mRNA對。雖然總體上，RNA和蛋白呈現正相關，但不同基因有不同的蛋白表達和RNA表達，一些相似豐度的RNA其蛋白表達量可能有高達1000倍的差異，這反應了蛋白合成和/或降解程度上的差異。這種蛋白和RNA表達的差異性就體現在蛋白/轉錄本比率上（protein-transcript ratio， PRT）?？傮w呈現一種向高PRT偏移的高斯分布，而高PRT蛋白數量是低PRT蛋白的3倍（下圖C）。核糖體相關的蛋白占了低PRT蛋白中很大一部分，而高PRT蛋白中很多是參與到代謝和生物合成過程等。PTR值的差異表明，不同的核糖核酸翻譯效率或蛋白質穩定性可能是肝竇蛋白質分帶的主要調節機制。
空間蛋白組學揭示沿著肝臟血管有不同的磷酸化分布
接下來分析了蛋白質表達沿肝竇的空間分布。發現有25%的蛋白是沿著肝小葉軸分區表達的（下圖A）。同時，磷酸化基序分析確定了116個保守基序。大約8%的蛋白質具有顯著的轉錄后調節，這導致蛋白質和核糖核酸之間的不同表達模式。約16%檢測到的磷酸化蛋白具有顯著分區變化，這表明磷酸化狀態的空間梯度是沿著肝竇的肝內皮細胞功能特征的主要決定因素。
酪氨酸磷酸化顯著富集中央靜脈區
為了進一步表征蛋白質磷酸化的空間排列，我們分析了3個主要磷酸化位點的分布。各分區絲氨酸磷酸化和蘇氨酸磷酸化的分布大致相等，但酪氨酸（p-Y）磷酸化則相對較嚴格的富集在中央靜脈區（CV）（下圖A）。不同磷酸化的空間占比分析更是直觀地表明，在CV中有大量的磷酸化酪氨酸（D&E）。作者分析前述的scRNA-seq發現，受體酪氨酸激酶（RTK）是在肝內皮細胞中表達豐度最高的激酶家族，而RTK磷酸化主要發生在中央靜脈區。總體，這一部分分析發現，肝小葉中磷酸化活性有明顯分區特點，中央靜脈區（CV）有顯著的受體酪氨酸激酶活性。
中央靜脈區酪氨酸激酶Tie1的磷酸化塑造了L-EC分區，同時產生了Wnt9b梯度
作者進一步聚焦具體的受體酪氨酸激酶（RTK），其中血管生成素受體Tie1和Tie2/TEK是高度分區表達的磷酸化蛋白。用Tie1-39對小鼠進行全身治療 ，2h后檢測基因的表達情況，在中央靜脈區比門靜脈結節的差異更顯著。最值得注意的是，心血管標志物基因Wnt9b的表達幾乎完全關閉，這表明Tie受體信號是血管Wnt表達的關鍵調節因子。STAT3促進Wnt9b轉錄，而FoxO1作為Wnt9b轉錄阻遏物。
Tie1誘導的Wnt對肝再生是必需的
作者進一步分析了Tie1-Wnt9b信號軸對肝再生的作用。作者構建了在內皮細胞中條件沉默Tie1的小鼠模型，并追蹤在切除小鼠2/3肝臟2天后的肝再生情況（下圖A&B）。結果發現，Wnt9b和Wnt2這兩個在肝內皮細胞中表達的Wnt 配體的表達顯著降低，而其他非特異表達的Wnt配體的表達量則未發現顯著差異（下圖C）。Wnt靶基因——Axin2 和 Tbx3的表達也顯著下調（下圖D&E）。相似地，兩個預示肝臟祖細胞高增殖能力的基因——Sox9 和 Lgr5的表達也顯著下調（下圖F&G），產生的結果就是，肝再生顯著受阻，在肝切除手術2天后，小鼠的肝重/體重值下降(下圖H)。總體來看，這些結果表明了Tie1信號依賴的Wnt生成是保持肝再生以及肝損傷后恢復肝質量的關鍵決定因素。
結 論
1.作者基于單細胞測序（scRNA-seq）的空間分選方法可以進行肝血管系統的多組學解析研究。
2.酪氨酸磷酸化富集在中央靜脈區。
3.Tie1- Wnt信號軸對肝再生具有關鍵促進作用。
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