仲春將至，新冠疫情的陰霾卻仍在繼續，德爾塔(Delta)、奧密克戎(Omicron)這些變異株可謂是一波不平一波又起。而值得慶幸的是，疫苗接種大大抑制了疫情的傳播速度，也是由于新冠疫情的爆發，大大加快了mRNA疫苗的發展。
mRNA疫苗相比于傳統疫苗具有免疫原性強、安全性高且易研發與生產等優點。伴隨著體外mRNA的合成、加工、遞送等技術不斷地成熟，mRNA疫苗藥物商業化生產的步伐在不斷加快。mRNA疫苗的生產過程需要經過序列設計、合成、驗證，模板線性化、體外轉錄，純化，濃縮，LNP包裝、純化，過濾除菌及罐裝等步驟。在以上的工藝生產過程中，需要對以下產物進行檢測：
?1.加帽率;?2.加Poly(A)尾產物長度;
?3.mRNA序列完整性、序列準確性;
?4.純度、副反應產物;
?5.殘留DNA;
?6.蛋白殘留、無菌、內毒素等;
針對mRNA疫苗的研發及生產，國家藥監局藥審中心在2020年8月發布了《新型冠狀病毒預防用疫苗研發技術指導原則(試行)》等5個指導原則的通告，其中對mRNA疫苗的生產工藝、質量特性、質量標準等進行了明確的說明。而對以上產物的檢測采用的方法包括質譜法、ELISA、毛細管電泳、一代或二代測序等，其優劣勢如下：
可以看到目前常規的檢測方法僅僅只能檢測其中某一項，為了盡可能同時檢測多個mRNA質量相關指標，安升達推出mRNA序列表征新方法，即利用Pacbio三代測序技術，同時檢測mRNA序列長度、序列準確性及完整性、PolyA尾長度等指標，對mRNA的序列特征、純度、產品相關雜質等質量特性進行準確質控，為mRNA疫苗安全性提供有效保證。
為了驗證技術流程的準確性，我們合成了不同PolyA長度(10-120nt)的RNA標準品進行測序分析，結果如下圖所示，隨著長度增加，polyA長度均呈現正態分布，仍保持高準確性。
圖1 利用合成的不同長度polyA標準品進行方法學驗證
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下機后的原始數據進行數據質量評估及數據過濾;
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質控后的CCS序列與mRNA序列進行比對分析;
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基于序列比對結果，進行mRNA測序深度及覆蓋度分析，以評估序列完整性;
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根據序列比對結果，進行序列特征分析，包括PolyA長度統計及RNA序列長度統計。
圖2 生信分析流程圖
基于以上分析內容，可以獲得mRNA的序列完整性、PloyA長度以及mRNA序列長度信息，結果如下：
(1)基于測序比對結果，統計mRNA長度，評估mRNA完整性
圖3 mRNA序列長度統計
(2)基于測序比對結果，統計mRNAPolyA長度分布
圖4 mRNA polyA長度統計
(3)基于測序比對結果，統計覆蓋度、測序深度和序列變異度，評估mRNA的序列完整性和準確性
圖5 mRNA完整性及準確性分析
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準確檢測mRNA polyA尾長度分布，無偏好性
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mRNA polyA長度檢測結果與質譜結果一致性高
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同時檢測mRNA polyA尾長度、序列完整性和準確性等多項指標
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