小編常常收到老師們的問題：我想做測序，我想做蛋白組學……但是我的樣本不夠啊，不符合你們的送樣標準，這可怎么辦!!!!
別著急小編今天就給大家介紹兩種絕對定量測序：UMI mRNA-seq和UMI miRNA-seq，完美解決樣本量不夠的問題，順便還能得到比常規測序更精準的結果，大家一起來了解一下。
什么是絕對定量測序
UMI(Unique Molecular Identifier)分子標記則通過隨機性利用不同的分子標簽，標記和區分不同的分子。絕對定量轉錄組測序（UMI-seq）通過在文庫擴增前為每一條逆轉錄的 cDNA 添加的分子標簽UMI，使同一個片段擴增出來的產物均帶有相同的標簽，天然重復片段則帶有不同的標簽。利用 UMI 過濾數據，可一比一準確還原樣本初始狀態。UMI標記測序的結果與Q-PCR檢測結果一致性高，甚至對于低豐度表達的基因也能較準確的測出
UMI 標記方式示意圖[1]
被隨機分子標簽標記的 cDNA 分子，在PCR擴增、建庫測序及后續分析過程中都攜帶著這個獨特的 UMI 標簽。分析的時候計數 UMI 的個數，通過去重的辦法去掉由于PCR偏好性多余擴增的UMI分子數，可以完美還原原始組成中不同RNA分子的比例，可實現原始RNA 分子的 “絕對定量”。
UMI絕對定量示意圖
絕對定量測序（UMI-seq）的產品優勢
一、更低的樣本量，建庫起始量低，mRNA-seq只需50ng，miRNA-seq只需200ng的Total RNA就能順利進行mRNA/small RNAseq，更適合量少與珍貴樣品；
二、更準確的定量分析結果，差異基因與Q-PCR驗證一致性更高,極大縮短實驗目標篩選時間。據文獻報道，普通RNA-seq和miRNA-seq與Q-PCR驗證的相關性為70%和35%，使用UMI建庫，相關性可以達到80%以上；
Q-PCR法測定已知量UMI與實際測試UMI量的相關性[3] Q-PCR驗證UMI miRNA差異基因分析[3]
三、更穩定的定量分析結果，避免低豐度基因丟失，可為致病及易感基因篩選等提供精準分析；
普通文庫實際定量與模擬定量計算的相關性和穩定性[2] UMI文庫實際定量與模擬定量計算的相關性和穩定性[2]
四、可區分天然重復和擴增重復的區別，準確識別可變剪切事件。
絕對定量測序（UMI-seq）測序方案
測序平臺：illumina Novaseq 6000
測序模式：PE150
絕對定量測序（UMI-seq）生信分析內容
UMI mRNA-seq分析流程
UMI miRNA-seq分析流程
絕對定量測序（UMI-seq）的應用范圍
比較轉錄組
要求精準的序列信息，從表達水平反應轉錄組進化的動態變化，并尋找潛在的驅動基因變化。
個體機制
要求準確的mRNA、smallRNA差異基因分析，構建miRNA及其靶基因的相關調控網絡。
互作轉錄組
寄生類RNA表達豐度較低，可通過增加PCR循環次數提高檢出率同時保證準確性。
生物標志物
適用于起始量較低或者富集較困難樣本。
【參考文獻】
1.S. Mangul, et al. UMI-Reducer?: Collapsing duplicate sequencing reads via Unique Molecular Identifiers. bioRxiv, 2017 pp. 1–11.
2.Katsuyuki Shiroguchi, Tony Z. Digital RNA sequencing minimizes sequence dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. PNAS. 2012, 109: 1347-1352.
3.Pieter Mestdagh,Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control(miRQC) study. Nature Methods. 2014, 29.