iTRAQ定量蛋白質組學分析研究狗牙根莖和枝葉差異
熱烈祝賀揚州大學動物科技學院 張兵老師及其團隊研究成果榮登BMC Genomics
基本信息
題目：Comparative proteomic analysis provides new insights into the specialization of shoots and stolons in bermudagrass (Cynodon dactylon L.)
期刊：BMC Genomics
影響因子：3.7
合作技術：iTRAQ
主要技術： iTRAQ蛋白組學 、RT-PCR、WB
研究背景：
狗牙根（Cynodon dactylon L.）作為一種重要的暖季型草種，廣泛分布于世界的溫暖地區，是家庭草坪、公園、高爾夫球場和運動場中使用最廣泛的草坪草之一。狗牙根具有典型直立莖莖干和匍匐莖的野草特征，在形態學上具有高度的可塑性，其結構特征可以通過外部環境因素而改變。然而，莖和枝葉之間的內在差異仍不清楚，這些差異為狗牙根的形態變異提供了基礎。近年來，通過運用高通量轉錄組學和蛋白質組學技術，為植物莖，特別是枝葉和匍匐莖的生長和發育提供了許多新的見解。在這項研究中，作者首次比較了陽江狗牙根品種在同一發育階段的枝葉和匍匐莖蛋白質組，分析差異蛋白及代謝通路，這些結果不僅擴展了對匍匐莖與枝葉專業化的理解，而且也為具有不同植物結構的狗牙根和其他草坪草的育種提供了線索。
技術路線：
1、狗牙根匍匐莖與枝葉在形態學和解剖學上的差異
作者首先從形態上比較了匍匐莖與枝葉的差異，為了揭示兩種不同類型莖在細胞水平上的差異，作者運用光學顯微鏡觀察比較兩者的橫截面。
圖1 形態學和解剖學觀察，顯示狗牙根匍匐莖與枝葉差異
陽江狗牙根匍匐莖長勢較好但枝葉相對長勢較弱（圖1a）。匍匐莖與枝葉均有典型的植物體節組成，包括節和節間。葉從枝節生長，新芽從莖節發芽。有趣的是，莖是匍匐生長，而枝葉則直立生長。盡管他們的節間直徑沒有顯著差異，但匍匐莖的節間長度明顯長于枝葉（圖1b）。在光學顯微鏡下觀察結果顯示：被脈管束包圍的枝葉實質細胞的體積大于匍匐莖實質細胞的體積；木質素染色結果表明匍匐莖中的血管束和表皮被嚴重木質化（圖1c和d）；淀粉染色結果進一步顯示，匍匐莖中薄壁組織細胞淀粉比枝葉中積累的更多（圖1e和f）。2、狗牙根匍匐莖與枝葉的節間蛋白質組比較
為了探索狗牙根匍匐莖與枝葉在形態學和解剖學差異的潛在機制，作者運用iTRAQ定量蛋白質組學技術，檢測兩種不同類型莖的差異蛋白。
圖2 匍匐莖與枝葉的節間蛋白質組比較
總共鑒定出4188種蛋白質，其中包含23581種肽段。在4188種蛋白質中，有3002種至少含有兩個特有肽段，覆蓋度大于等于20%的蛋白數有1867種（圖2a和b）。 變異系數（CV）用于評估生物樣本的重復性。結果表明當CV的閾值設置在20%時，兩組樣本的CV累計百分比分別為78.02和68.5％（圖2c）。 兩組之間的比較表明，大多數蛋白質在匍匐莖和枝葉顯示出相似的豐度，有8.98％（376）的蛋白質顯示顯著差異（圖2d）。 3、iTRAQ定量蛋白質組與轉錄組的關聯分析及RT-qPCR驗證
作者將蛋白質組學結果與轉錄組學結果進行了關聯分析，并對蛋白組學結果進行了RT-qPCR驗證。
圖3 蛋白質組與轉錄組的關聯分析及RT-qPCR驗證
BLAST結果顯示，編碼113個差異蛋白（DAP）的基因同時也是轉錄組差異表達的基因（DEG），其余編碼263個DAP的基因未被鑒定到（圖3a）。iTRAQ定量蛋白質組結果與轉錄組數據結果的比較表明，多達93個DAP和相應的DEG表現出相似的蛋白質豐度變化和mRNA表達變化趨勢（圖3b）。RT-qPCR結果表明，10個基因的差異表達，與組學結果相符（圖3c）。但是，有2個基因表達差異倍數在mRNA水平與蛋白質水平上均不同，這表明這些基因的表達在轉錄后受到調控。4、差異蛋白的功能富集分析
為了探究差異蛋白的潛在功能，作者對差異蛋白進行了GO和KEGG富集分析。
圖4 顯著富集的代謝通路
GO注釋分析表明376個DAP可注釋到29個功能分類上，蓋了許多重要的生物學和細胞過程，包括代謝，運輸，生長，發育，轉錄，信號轉導和對刺激的反應。這些結果表明，許多重要的生物過程在匍匐莖與枝葉中受到不同的調節。KEGG注釋分析進一步表明，在匍匐莖中有5條顯著富集的代謝通路，在枝葉中有9條顯著富集的代謝通路（圖4）。
圖5參與碳水化合物代謝途徑的差異蛋白質種類
根據組學結果，催化糖酵解必不可少的酶，包括焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶(PFP)，果糖二磷酸醛縮酶（ALDO），磷酸甘油酸變位酶（PGAM）和bing酮酸激酶(PK)，這些蛋白在枝葉中的蛋白豐度要高于匍匐莖（圖5）。催化蔗糖降解和細胞壁成分（纖維素和木質素）合成的酶，包括蔗糖合酶（SuS）的三種同工型，苯丙氨酸氨解酶（PAL）的三種同工型，UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）和 纖維素合酶（CS），也是在枝葉中表達較高（圖5）。相反，參與淀粉合成的酶，包括AGPase，淀粉合酶（SS），1,4-α-葡聚糖分支酶（GBE）和異淀粉酶（ISA），在匍匐莖中有更高的蛋白質豐度（圖5）。5、狗牙根匍匐莖與枝葉中AGPase和PK的酶活性
AGPase和PK分別是淀粉合成和糖酵解途徑的兩種限速酶。為了進一步證實iTRAQ定量結果，驗證AGPase和PK蛋白質的豐度，作者運用WB驗證技術。另外，作者還測定了AGPase和PK的酶活性，并進行了比較分析。
圖6 五種狗牙根莖和枝葉中AGPase及PK的蛋白豐度及酶活性比較
結果表明，AGPase和PK分別在莖和枝葉中優勢表達（圖6a）。在狗牙根的其他四個野生種中也觀察到了相似的結果。此外，陽江品種和C437和C452野生種的莖顯示出比野生種C690和C726較高的AGPase蛋白豐度，盡管二者枝葉中也有相對較高的AGPase表達（圖6a）。與iTRAQ定量和WB分析結果一致，莖中的AGPase活性高于枝葉中的AGPase活性，而枝葉中的PK活性更高（圖6b和c）。此外，陽江品種的莖和枝葉與野生種C437和C452之間的AGPase活性差異大于野生株C690和C726的莖和枝葉之間的AGPase活性差異，而后兩個野生種的PK活性差異更大。這些結果與KOBAS分析結果相結合，共同暗示淀粉合成和糖酵解分別在莖和枝葉中具有很高的活性。6、狗牙根匍匐莖與枝葉中可溶性糖和淀粉含量
作者進一步測定了五株狗牙根匍匐莖與枝葉中可溶性糖和淀粉的含量。
圖7 五種狗牙根莖和枝葉中碳水化合物含量比較
在五種植物中，枝葉比莖含有更多的可溶性糖及更少量的淀粉，這與淀粉染色結果一致（圖7a和b）。具體而言，五種狗牙根的莖中均顯示相似的可溶性糖含量，而野生種C690和C726的莖中可溶性糖含量明顯高于其他三株（圖7a）。 同樣，野生種C690和C726的枝葉淀粉含量比陽江和野生種C437和C452的淀粉含量高1.5倍。相反，野生種C690和C726的莖淀粉含量明顯低于其他三種狗牙根（圖7b）。
圖8 五種狗牙根表型比較
有趣的是，五株狗牙根也表現出明顯的形態變異（圖8a）。具體而言，五株植物的苗高不同（圖8a）。野生種C690和C726的最高枝葉分別達到25 cm和18 cm，均明顯高于陽江品種和野生種C437和C452的高度（圖8b）。因此，野生種C690和C726的莖/枝干重量比明顯低于其他三種植物（圖8c）。這些結果表明，在枝葉中積累并消耗更多糖的狗牙根品種，其長勢要比在莖中儲存更多淀粉的品種高。結論：
該研究中，作者主要運用iTRAQ定量蛋白質組技術比較了陽江狗牙根匍匐莖與枝葉蛋白質組，成功鑒定到在莖和枝葉中優勢表達的蛋白，通過對這些蛋白的功能注釋分析，找出了他們顯著富集的代謝通路。作者同時也結合了轉錄組學關聯分析、RT-qPCR和WB實驗技術對蛋白組學結果進行驗證，通過酶活性比較、碳水化合物含量比較等實驗，揭示了參與淀粉合成和糖酵解的酶在莖和枝葉中分別顯示出相對較高的豐度和活性，再加上莖中有較高的淀粉含量，而枝葉有較高的可溶性糖含量，這些結果都強有力的表明在狗牙根快速繁殖生長期間，莖和枝葉專門用于不同生理功能。