2006年是熒光顯微鏡學的奇跡之年。而與之相媲美的另一個年份是1905年，當時愛因斯坦以相對論、量子論和原子物理學變革了物理領域。而這場顯微鏡學革命，則是由3篇論文組成的，科學家首次能窺見細胞內部并追蹤單個分子的行為。

“每個分子是一臺機器，一臺納米機器?！盉ewersdorf說。其中，蛋白質是尤為復雜的分子，它們以多種方式彎曲纏繞，執行細胞新陳代謝和生長需要的反應?！拔覀兏信d趣的是，這些微型機器是如何整合在一起完成細胞機能的？”

長期以來，光學顯微成像技術的發展一直受制于一個物理極限值的約束，也就是德國物理學家、顯微技術專家恩斯特·阿貝在1873年提出的預言：光學顯微鏡的成像效果被認為受到光的波長限制，無法突破0.2微米，即光波長1/2的分辨率極限，此后被稱為“阿貝分辨率”。

在能夠窺見細胞內部之前，科學家對該問題并沒有清晰的答案。光學顯微鏡無法提供任何幫助，超越一定放大率后，衍射使得光線四散而非集中于一點。任何距離小于200納米或寬度是細胞膜40倍的物體都會變成一個模糊點。使用電子顯微鏡制作的圖片能分辨精細結構，但必須是靜態的，無法用于活細胞。

2006年，3個實驗室各自采用相似策略克服了“衍射障礙”：利用專業的熒光探針分析樣本。這些探針能被有選擇地開啟，直到所有探針能在一系列圖像中被捕捉到?？茖W家能像印象派畫家利用顏色點構建一個場景那樣將這些圖像制作成一張圖片。這3個技術——光敏定位顯微鏡（PALM）、熒光PALM（FPALM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM），能區分出相距20納米的目標，產生單分子尺度的熒光照片。這些技術為研究人員插上前進的翅膀。例如，Bewersdorf在美國耶魯大學的實驗室正為活動在活細胞表面的蛋白質“照相”。

自2006年到現在的10年間，這3個技術掀起了技術和方法的革新浪潮。2014年，德國馬克斯普朗克學會生物物理化學研究所的Stefan Hell、美國霍華德·修斯醫學院珍妮莉婭法姆研究院的Eric Betzig和美國斯坦福大學的William Moerner提出的打破衍射極限的成像策略使他們成為諾貝爾化學獎得主。研究人員目前正在制造更明亮的熒光探針，以便照亮未曾展現在人們面前的細胞進程。

“令人興奮的是，這些技術讓觀察活細胞成為可能?！闭淠堇驄I法姆研究學院Jennifer Lippincott-Schwartz說，“目前，使用熒光探針拍攝單個蛋白質時機已經成熟?！?br />
更持久、更明亮

這3個超分辨率顯微鏡技術都是依靠綠色熒光蛋白質（GFP）等化合物發出光線的。這些物質的基因能被插入編碼細胞蛋白質的基因中。然后，生成的蛋白質中則附著著熒光物質，并通過發出熒光顯示其存在位置。

但這些技術均存在限制。一個大問題是，在被刺激其發光的激光徹底損壞前，這些探針只能發出極為有限的光。甚至在光褪色效應發生前，探針的光已經非常微弱了。

而這些探針的綜合版本有機染料，能發出更明亮的光，但卻無法編碼目標基因，并插入細胞內部。相反，它們通常與能找到蛋白質的抗體結合在一起。但這種組合使得探針過大，無法穿過細胞膜或干擾蛋白質功能?！斑@些探針確實存在限制。”Bewersdorf說。

幸運的是，革新正在出現。Bewersdorf團隊正在與兩個團隊合作研究可點擊化學探針：新英格蘭生物實驗室的SNAP-tag和普洛麥格生物技術公司的HaloTag。這些技術包含一種能被編碼到興趣蛋白質中的較短的靶序列和一個能通過簡單化學反應嵌入靶蛋白中的染色分子。Bewersdorf和同事已經證明這兩種技術能使用有機染料作用于活細胞。

另外，研究人員還求助于量子點——納米級半導體。這種物質不僅明亮且持續一個月甚至更久，還能與生物分子相連接。新墨西哥大學生物物理學家Diane Lidke在細胞傳導實驗中就使用了量子點。但量子點存在一個缺點：體積過大。市場上能買到的量子點都有一個殼，這讓其直徑大了15~25納米。與只有4納米寬的熒光蛋白質相比，“它們太大太笨重了”。

這一缺點意味著研究人員很難將量子點放入細胞或其他緊密空間中，但能有效應用于在細胞外基質和膜結合蛋白中。在與其丈夫、該校物理學家Keith Lidke的合作中，Lidke開發出了多色、快速、單分子追蹤技術，能用量子點在定制顯微鏡中生產圖片。

打開細胞

穿越細胞膜是熒光顯微鏡面臨的最大障礙之一?！凹幢阒挥?納米厚，細胞膜已經進化了數十億年，以便隔離細胞內外，而且，效果出奇地好。”伊利諾伊大學香檳分校生物物理學家Paul Selvin說。

Selvin的實驗室開發出的量子點更小，直徑接近9納米。這一尺寸能讓他將量子點滑過神經細胞之間20~40納米的空隙，信息傳導分子經由這里向相鄰神經細胞傳遞信息。一旦進入這里，量子點能束縛并突出幫助記憶形成的受體的存在。雖然Selvin并沒有將這些量子點植入活細胞內，但他認為這是可行的。

該實驗室還計劃在細胞膜上穿孔，然后迅速密封起來，以避免破壞細胞?！拔覀兡軌蚴褂靡环N名為鏈球菌溶血素的細菌酶在細胞膜上鉆一個約5納米的微小孔洞?！盨elvin說。這一寬度足以讓熒光蛋白質通過，甚至是聯合了抗體的蛋白質，以便尋找細胞內部的目標物體。之后，研究人員能利用尚未發表的方法在20分鐘內修補這些孔洞。

另外，還有人擔憂，這些探針會干擾靶蛋白的功能。而約翰斯·霍普金斯大學生物物理學家Jie Xiao則提出了一個不會損傷這些蛋白質的替代方案。

她的探針分子經過基因修飾，并非附著在目標分子上，它們被制作出來后，就立刻被一種酶劈開，并進入細胞膜的一個特定位置。這就意味著它們不再攜帶靶分子的位置信息，但卻位于能對其進行精確計算的位置，并由此獲得蛋白質產生的精確計數，同時，蛋白質本身能自由發揮功能。Xiao將該技術稱為裂解共轉化活化（CoTrAC）。

“量化活細胞的蛋白質水平非常重要?！盭iao解釋道，“人們通常使用熒光指示出相對變化?！钡溲芯康幕蛘{控蛋白質極少，很難用超分辨計數成像。此外，這些蛋白質的精確數字的細微變化也能判斷細胞狀態改變與否。

讓背景暗下去

除了更明亮，另一個讓探針脫穎而出的方法是降低背景亮度。德國波恩大學生物物理化學家Ulrich Kubitscheck表示，“細胞中也有擴散的背景。”非靶蛋白甚至本身就有天然、暗淡的熒光，這就造成了背景噪音。如果減少背景噪音，圖像的清晰度就會提高。

因此，研究人員不斷改進亮度策略。Kubitscheck實驗室使用激光層照顯微技術生產一個非常細的精確聚焦光束，該光束能從側面穿過樣本。“我們建造了一些下部和四周透明的玻璃室?！彼f。通過從側面而非頂部向樣本照射光線，該團隊照亮了一個200~300納米厚的切片，并從下部對樣本進行觀察?？茖W家利用這種方法，看到RNA分子經過一種名為核膜孔的蛋白質絡合物輸出，進入細胞質。在這里，它們開始指揮蛋白質合成。


能進行激光層成像的顯微鏡已經商業化。具備專業知識的研究團隊已經組成，并開始定制自己的顯微鏡。

而下一代選擇性平面照明顯微術被稱為晶格光片顯微鏡，誕生自Betzig的實驗室。項目合作者、珍妮莉婭法姆研究院細胞生物學家Zhe Liu說，該技術能產生300~500納米厚的照明平面，其優點在于光點的結構。晶格能形成一個三維網格，照亮樣本的連續剖面。

總之，顯微鏡技術在生物學發展歷程中至關重要，尤其是早期顯微術領域的某些重要發現，直接促成了細胞生物學及其相關學科的突破性發展。隨著生命科學的研究由整個物種發展到分子水平，顯微鏡的空間分辨率及鑒別精微細節的能力已經成為關鍵技術問題。光學顯微鏡的發展史就是人類不斷挑戰分辨率極限的歷史