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AAT 研發(fā)的新型鈣離子熒光探針 點亮你的科研之路

簡介

Calbryte?520，Calbryte?590和Calbryte?630提供最強大的均勻熒光測定工具，用于檢測細胞內(nèi)鈣動員。與現(xiàn)有的鈣指示劑（如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，這些鈣敏感染料明顯更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了細胞內(nèi)保留和負載效率。表達通過鈣發(fā)出信號的GPCR或鈣通道的細胞可以預裝載穿過細胞膜的Calbryte^TM520 AM，Calbryte^TM590 AM或Calbryte^TM630 AM。一旦進入細胞內(nèi)，Cal520?AM，Calbryte?590 AM或Calbryte?630 AM的親脂性阻斷AM基團被細胞內(nèi)酯酶切割，產(chǎn)生帶負電荷的熒光Calbryte?染料，留在細胞內(nèi)。它們與鈣結合后的熒光大大增強。當用激動劑刺激細胞時，該受體表達細胞內(nèi)鈣的釋放，這顯著增加了Calbryte?520，Calbryte?590或Calbryte?630的熒光。高靈敏度和>100倍熒光增強的特性使Calbryte?520 AM，Calbryte?590 AM或Calbryte?630 AM是測量細胞內(nèi)鈣的最強大指標。

除了方便的激發(fā)波長和鈣的大熒光增強外，Calbryte?520，Calbryte?590和Calbryte?630主要定位于細胞溶膠中，不像Rhod-2主要位于線粒體中。此外，Calbryte?590和Calbryte?630的Ex/Em波長使這些染料成為完美的鈣指示劑，可與綠色熒光蛋白（GFP）細胞系進行多色檢測。此外，Calbryte?520，Calbryte?590或Calbryte?630鈣測定經(jīng)過優(yōu)化，可與大多數(shù)現(xiàn)有熒光儀器兼容。Calbryte?520可在488nm處激發(fā)，并與FITC濾光片組配合使用。Calbryte?590經(jīng)過優(yōu)化，可在555nm激發(fā)，并與TRITC/Cy3濾光片組配合使用。Calbryte?630經(jīng)過優(yōu)化，可在594 nm激發(fā)，并與TexasRed?濾光片組配合使用。光譜和鈣結合特性總結如下（參見表1）。

表1.Calbryte?520，Calbryte?590或Calbryte?630

試劑的光譜和Ca²⁺結合特性

使用Calbryte?520 AM ,Calbryte?590 AM 或Calbryte?630 AM酯類

1.使用Calbryte?520，Calbryte?590或Calbryte?630 AM酯類稱重傳感器：

Calbryte?AM酯應在使用前在無水DMSO中重新配制。DMSO儲備溶液可以在-20℃下儲存（干燥）并避光。在這些條件下，AM酯應穩(wěn)定三個月。

以下是我們推薦的將Calbryte?520 AM，Calbryte?590 AM或Calbryte?630 AM酯加入活細胞的方案。 該說明僅提供指南，應根據(jù)您的特定需求進行修改。

a）在無水DMSO中制備2至5mM Calbryte^TM520AM，Calbryte^TM590 AM或Calbryte^TM 630 AM酯的儲備溶液。

b）將Calbryte^TM520 AM，Calbryte^TM590 AM或Calbryte^TM630 AM溶解在DMSO中或將等份的指示劑儲備溶液解凍至室溫。在Hanks和Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液（0.04％Pluronic?F-127）中制備10至20μM的染料工作溶液。細胞加載所需指示劑的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。

注意：非離子型洗滌劑Pluronic?F-127有時用于增加Calbryte?520 AM，Calbryte?590 AM或Calbryte?630 AM酯的水溶性。 各種Pluronic?F-127解決方案可從AAT Bioquest獲取。

c）如果您的細胞（如CHO細胞）含有有機陰離子轉運蛋白，可將丙磺舒（1-2 mM）添加到染料工作溶液中（最終濃度為0.5-1 mM）

注意：各種ReadiUse?丙磺舒（包括水溶性鈉鹽和穩(wěn)定溶液）均可從AAT Bioquest獲取。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細胞板中。

e）將染料加載板在細胞培養(yǎng)箱中孵育約60分鐘，然后將板在室溫下再孵育15分鐘。

f）用HHBS或您選擇的含有陰離子轉運蛋白抑制劑（如1 mM丙磺舒）的緩沖液替換染料工作溶液，以去除多余的染料。

g）對于Calbryte^TM520 AM，在Ex/Em=490/525nm處進行鈣測試，對于Calbryte^TM590 AM，使用540/590nm進行鈣測試，對于Calbryte^TM630 AM，使用610/640nm進行鈣測試。