編者按
急性心肌梗死（AMI）是一種危及生命的心血管急癥，以其高發病率、高死亡率成為常見的急危重癥疾病。與哺乳動物不同，斑馬魚通過心肌細胞（CMs）的增殖來實現心臟的完全再生。
今天，我們分享2025年2月由德國烏爾姆大學、博羅尼亞大學等研究團隊聯合在《Nature Communications》雜志上發表的最新研究，該研究表明克服復制壓力的能力是增強斑馬魚心臟再生能力的關鍵因素，并揭示了BMP信號在促進無壓力DNA復制中的作用。
研究發現，再生的心肌細胞經歷DNA復制壓力，是哺乳動物衰老過程中組織再生能力下降的原因之一。通過抑制ATM和ATR激酶，表明DNA損傷應答信號對斑馬魚心臟再生至關重要。利用轉基因和突變體操縱骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-Smad信號表明，BMP信號可緩解心肌細胞的復制壓力，也能使新生小鼠的心肌細胞、人類成纖維細胞、人造血干細胞（HSCs）及祖細胞（HSPCs）免受復制壓力的影響。DNA纖維測定技術分析表明，BMP信號可以在復制壓力導致的停滯后重新啟動復制叉。
文章題目
BMP signaling promotes zebrafish heart regeneration via alleviation of replication stress
雜志：Nature Communications（IF=16.6）
發表時間：2025年2月17日
作者：Mohankrishna Dalvoy Vasudevarao, Hartmut Geiger &Gilbert Weidinger et al.
單位：德國烏爾姆大學、博羅尼亞大學等
DOI: 10.1038/s41467-025-56993-6
01、研究亮點
• 首次證明斑馬魚心臟再生過程中，增殖的心肌細胞（CMs）會經歷顯著的DNA復制壓力，這被認為是哺乳動物衰老過程中組織再生能力下降的關鍵限制因素；
• 發現骨形態發生蛋白（BMP）信號通路，特別是BMP7a配體通過Smad依賴性途徑，在緩解心肌細胞復制壓力中的核心作用。BMP信號通過促進停滯的復制叉重新啟動（fork re-start）來實現這一功能；
• 證明DNA損傷響應通路對斑馬魚心臟再生至關重要，抑制ATM及ATR激酶會阻斷心肌細胞增殖和再生；
• 研究發現，斑馬魚心臟再生并非避免了復制壓力，而是具備了BMP信號等強大的機制來克服這種壓力，為理解再生能力差異和開發抗衰老、促再生策略提供了新視角。
02、研究結果
1. 斑馬魚心臟再生過程中心肌細胞變為γH2a.x陽性
為了探究心臟再生機制，研究人員分析了斑馬魚心臟轉錄組，注意到與DNA修復相關的基因特征在損傷后7天（dpi）富集，這代表了CM增殖的高峰期。qRT-PCR顯示，在冷凍損傷的心臟中，多種DNA損傷反應通路的基因在7dpi時上調。位于傷口邊緣的心肌細胞(CMs)是心臟再生的關鍵，用于分化、增殖以替換受損的心肌。利用單細胞測序發現，一些上調的DNA修復相關基因在7dpi時，其傷口邊緣區的心肌細胞(CMs)表達比遠端的更強。
通過蛋白質印跡檢測到，7dpi時心臟中的DNA損傷標志物——γH2a.x水平升高；免疫熒光顯示，在7dpi時，傷口邊緣的一部分心肌細胞呈γH2a.x陽性，且與細胞周期的進展密切相關。γH2a.x陽性心肌細胞的數量隨傷口距離而減少。經心尖切除術(AR)的再生新生心臟組織(AR-Neo-EVs)中也觀察到了γH2a.x陽性心肌細胞。這些數據表明，再生心臟中的心肌細胞經歷了DNA損傷，但與損傷類型無關，且不太可能直接由損傷本身引起。
隨后，研究人員利用DNA氧化損傷的重要標志物——8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)進行了酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 。實驗結果顯示，心臟外植體的過氧化物處理誘導了DNA氧化，但與未受傷的心臟相比，僅冷凍損傷并未增加8-OHdG水平。這表明，斑馬魚的DNA氧化損傷不太可能是心肌細胞中γH2a.x陽性（即DNA損傷反應）的原因。
2. 心肌細胞在再生過程中經歷復制壓力
γH2a.x積累的時間和空間分布特征表明，在傷口邊緣進入細胞周期的心肌細胞經歷了DNA損傷。研究人員在7dpi時對γH2a.x和EdU標記進行染色后發現，γH2a.x陽性主要出現在最近或仍在分裂的心肌細胞，這表明心肌細胞變為γH2a.x陽性是因為在再生過程中其進入細胞周期時經歷了復制壓力。
在未受傷心臟中，只有0.62%的心肌細胞是γH2a.x陽性，而用羥基脲（HU）處理，其消耗細胞的核苷酸從而引起復制壓力，誘導了γH2a.x陽性。EdU和γH2a.x的雙重染色顯示，在分裂中的心肌細胞，γH2a.x積累很少見（2.3%），但HU處理可顯著增加其比例。同樣，在冷凍損傷的心臟中，HU處理增加了γH2a.x陽性心肌細胞的比例。這些數據表明，γH2a.x通常并不標記分裂中的斑馬魚心肌細胞，而是作為復制壓力的可靠指標。
γH2a.x在細胞核中的定位也指示了DNA損傷的不同類型。如，電離輻射主要導致雙鏈斷裂，從而引起再生心臟的心肌組織中出現明顯的點狀γH2a.x積累，而HU則引起泛核γH2a.x染色。在未受干擾的再生心臟中，84%的γH2a.x陽性心肌細胞顯示泛核γH2a.x分布。磷酸化Rpa32是形成單鏈DNA結合蛋白RPA復合物的一部分，磷酸化Rpa32積累被認為是復制壓力的特異性指標。蛋白質印跡顯示，在7dpi時，心肌心室組織中p-Rpa32（S33）水平顯著增加。因此，通過γH2a.x積累可以發現，傷口邊緣的心肌細胞經歷復制壓力。
為了進一步研究再生心臟中心肌細胞增殖與γH2a.x積累之間的相關性，研究人員使用CDK4/6抑制劑PD-0332991來直接抑制細胞周期進程，結果發現，7dpi時顯著減少分裂期pH3陽性心肌細胞和γH2a.x陽性心肌細胞的數量。需要注意的是，生理狀態下心肌細胞的增殖不會引起γH2A.X陽性的累積，而在心臟受傷時，γH2A.X會在心肌細胞中累積?？傊?，這些發現表明，心肌細胞的復制壓力是由再生需求誘導的特異性引起，而不是由生理性生長誘導的。
此外，通過HU處理誘導的外源性復制壓力并不影響心肌細胞去分化的三個指標，即祖細胞標志物gata4調控區活性的轉基因的上調、胚胎肌球蛋白（embMHC）的上調或肌節的解體，這表明心肌細胞去分化獨立發生。
3. 心肌細胞復制壓力可能并非由DNA損傷積累或轉錄碰撞引起
在幼魚期（42天）、成年早中期（6個月）和老年期（2歲）的斑馬魚再生心臟中，并未觀察到γH2a.x陽性心肌細胞比例的增加，這表明心肌細胞復制壓力不太可能由存在的DNA損傷阻礙復制叉引起。而針對活性、延伸的磷酸化RNA聚合酶II的免疫染色顯示，傷口邊緣心肌細胞的總體轉錄水平低于心室其他區域，這表明心肌細胞的增殖也不大可能是由轉錄碰撞引起的。
4. DNA損傷信號傳導對心臟再生是必需的
隨后，研究人員探究了經歷復制壓力的心肌細胞是否會衰老或凋亡。在7dpi時，衰老標志物β-半乳糖苷酶在心外膜細胞中表達上調，而非心肌細胞中，這與先前在再生斑馬魚和新生小鼠心臟中的報道一致。用HU處理則并未誘導心肌細胞衰老，因此，經歷復制壓力的心肌細胞不會衰老。
在未受干擾的再生心臟中，通過檢測Caspase3的積累發現，只有0.27%的傷口邊緣心肌細胞凋亡，而電離輻射可以誘導了心肌細胞凋亡。這表明，盡管斑馬魚心肌細胞保留了響應DNA損傷誘導促凋亡信號的能力，但經歷復制壓力的斑馬魚心肌細胞能克服復制壓力并繼續增殖。
基于此，感知復制壓力的DNA損傷通路可能對心臟再生是必需的。因此，研究人員又利用ATM和ATR激酶的抑制劑來分別介導對DNA損傷和復制壓力的細胞反應，并觀察其在斑馬魚中是否有效。研究發現，ATM抑制劑KU55933和ATR抑制劑VE821是無毒的，其不影響胚胎發育，但用ATR抑制劑處理的胚胎在單獨使用小劑量的HU中出現壞死，而ATM抑制劑則加劇了低劑量電離輻射的影響，表明這些抑制劑阻斷了斑馬魚細胞響應復制壓力，以及其他形式的DNA損傷激活修復通路的能力。
研究人員還發現用ATR抑制劑VE821處理斑馬魚24小時后，在7dpi時減少再生心臟中的心肌細胞有絲分裂。已知ATM和ATR激酶通路可以交叉作用，以促進復制壓力反應，聯合使用ATM和ATR抑制劑比單獨使用ATR抑制劑，更顯著地抑制了心肌細胞的有絲分裂，且兩種抑制劑聯合治療也損害了心臟的再生修復。總之，這表明，由ATR介導，并有ATM參與的DNA損傷修復通路的激活，對再生性心肌細胞增殖和心臟再生至關重要。
5. BMP信號傳導緩解心肌細胞復制壓力
我們先前已證明在斑馬魚心臟再生過程中，BMP信號在傷口邊緣的心肌細胞中CMs中被激活，但在生理性生長條件下則不會被激活，且它對再生性心肌細胞的增殖至關重要。因此，研究人員探究了BMP信號是否調節斑馬魚心肌細胞的復制壓力，結果顯示，表達nog3的斑馬魚在7dpi時顯示出更高比例的γH2a.x陽性心肌細胞，而過表達BMP配體bmp2b則有效地減少了γH2a.x陽性心肌細胞的數量。在7dpi時，單次誘導bmp2b過表達可以在6小時內顯著減少γH2a.x陽性心肌細胞的數量，這表明BMP信號可以直接作用于經歷復制壓力的增殖心肌細胞。
過表達bmp7b或bmp4也可以減少γH2a.x陽性心肌細胞的比例。在7dpi時，γH2a.x陽性心肌細胞的比例增加，p-Smad1/5/9水平降低，而突變體和野生型心臟之間則沒有形態學差異。因此，在再生過程中，內源性BMP信號緩解心肌細胞復制壓力是必需的，且Bmp7a作為不可替代的配體也在其中發揮作用。有趣的是，在HU處理的斑馬魚中，nog3過表達進一步增加了γH2a.x陽性心肌細胞的比例，而bmp2b過表達則顯著降低了這一比例。這些結果表明，BMP信號不僅可以緩解內源性復制壓力，也能緩解外源性復制壓力。
6. BMP通過Smad發揮作用以抑制復制壓力
BMP配體可以激活Smad依賴性和非依賴性信號通路。為了探究BMP是否通過Smad緩解斑馬魚心臟的復制壓力，研究人員創建了轉基因品系hsp70l:nT-p2a-smad6bulm16Tg來比較nT+和nT-的心肌細胞。在7dpi熱休克后6小時內，nT+心肌細胞通過磷酸化Smad1/5/9核積累顯示出Smad信號傳導被抑制，nT+心肌細胞比野生型或nT-心肌細胞呈γH2a.x陽性的頻率高出3倍。因此，BMP/Smad信號傳導在心肌細胞中可以自主緩解復制壓力。
為了驗證過表達的BMP配體是否僅通過Smad通路發揮作用，研究人員分析后發現，bmp2b過表達增加了p-Smad1/5/9+心肌細胞的比例，而smad6b降低了該比例，但在雙轉基因魚中，p-Smad1/5/9+心肌細胞的比例與野生型中觀察到的一致。僅表達bmp2b的斑馬魚顯示γH2a.x+心肌細胞數量顯著減少，但smad6b的過表達可以逆轉bmp2b過表達對γH2a.x的影響?？傊?，這些數據表明BMP信號直接在心肌細胞中，通過Smad發揮作用，以緩解復制壓力。
為了探究抑制BMP/Smad信號傳導對形態學心臟再生和瘢痕形成的長期影響，研究人員對冷凍損傷的轉基因斑馬魚及其野生型斑馬魚每日熱休克，連續處理21天，評估傷口大小和膠原沉積。在3dpi時傷口大小沒有差異，但冷凍損傷心臟在21 dpi時顯示出更大的傷口，且傷口含有許多膠原。這表明，BMP/Smad信號傳導對心臟再生和瘢痕消退是必需的。
7. BMP信號傳導促進無壓力復制和有絲分裂進程
在冷凍損傷的斑馬魚中，單次誘導smad6b表達在6小時內減少了pH3陽性有絲分裂心肌細胞的比例。通過重復EdU注射標記受傷的野生型和轉基因斑馬魚，觀察其增殖的心肌細胞3天，并在7dpi時染色，發現單個心肌細胞不會經歷多輪細胞分裂，在4、5或6dpi時增殖的少數心肌細胞在7dpi時仍在增殖，此時許多心肌細胞已不再增殖。在熱休克的野生型斑馬魚中，在7dpi時只有約35%的EdU+心肌細胞是PCNA+的，通過過表達nog3抑制BMP信號傳導增加了EdU+PCNA+心肌細胞的比例，smad6b過表達增加了PCNA+ CMs的比例，但減少了CM有絲分裂，這表明smad6b誘導了心肌細胞周期延遲，導致正在進行細胞周期的心肌細胞增加。
隨后，研究人員又重復EdU注射標記增殖的心肌細胞，對EdU和γH2a.x進行染色，發現EdU+γH2a.x陽性心肌細胞經歷復制壓力，而僅EdU+的心肌細胞則無壓力復制。過表達nog3會增加EdU+γH2a.x陽性心肌細胞的。總的來說，這表明，BMP信號傳導特異性促進心肌細胞增殖，使心肌細胞能夠克服復制壓力，并進入有絲分裂。
接下來，為了探究BMP信號激活能否促進心肌細胞細胞周期進程和無壓力復制，研究人員發現，在未受干擾的條件下，bmp2b過表達不會降低PCNA+ EdU+ 心肌細胞的比例，但能緩解由HU處理引起的數量增加。無論是在未受干擾條件下還是在HU誘導的復制壓力下，bmp2b過表達都能增加經歷“無壓力”復制的EdU+ γH2a.x-心肌細胞的比例。
8. BMP信號在哺乳動物及人類細胞中的保守性
隨后，研究人員進一步探究了BMP信號在哺乳動物及人類細胞中緩解復制壓力的能力。哺乳動物實驗結果表明，成纖維細胞/U2OS細胞中，BMP2+BMP4預處理可防止HU誘導的γH2a.x積累；造血干細胞/祖細胞 (HSPCs)中，BMP2預處理可完全挽救HU對原代人骨髓HSPCs集落形成能力的損傷；重組BMP2或BMP7蛋白處理可保護培養的新生小鼠心肌細胞免受HU誘導的復制壓力，減少γH2a.x+細胞，且這種保護作用具有特異性。
通過DNA纖維鋪展分析顯示，BMP信號在人臍帶血HSPCs/U2OS細胞中表現為CldU/IdU軌道長度增長， BMP2或BMP4處理能增加復制叉的進程速度；在U2OS細胞中，HU誘導復制叉停滯的模型則能通過BMP2或BMP4預處理，顯著提高復制叉再啟動的比例。BMP信號能增強復制動力學，少部分通過增強復制叉重新啟動能力來緩解復制壓力。
03、編者點評
本研究利用斑馬魚揭示了復制壓力是限制組織再生，尤其是心臟再生的關鍵瓶頸，并發現BMP-Smad信號通路作為克服這一瓶頸的核心保守機制，為理解再生生物學和開發再生醫學策略提供了重要的新見解。
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