細胞內遺傳物質的穩定受自身與外界多種因素影響，DNA雙鏈斷裂（DSB）可以通過細胞呼吸過程中累積的氧化應激自發產生，也可以通過宇宙射線和癌癥患者的治療性輻射外源產生。這些受損DNA打破了細胞穩態，會引起基因突變、染色體畸形，進而導致細胞死亡或惡性轉化為腫瘤細胞。衰老、DNA修復、免疫和腫瘤四者是緊密關聯的。

維持基因組完整性對于正常的細胞功能至關重要。因此，生物體通過識別DNA損傷位點，激活一系列生化通路，協調DNA復制與轉錄，使損傷DNA得以修復，維持機體的穩定。DNA損傷修復的研究有助于了解基因突變的機制、衰老和癌變的原因，還可應用于環境致癌因子的檢測。表征調控DSB修復的因素和途徑對于了解致癌事件期間的誘變過程和開發適當的癌癥療法非常重要。

染色體斷裂修復如此重要，那要如何對其不同修復途徑進行檢測呢？小編帶你一起來看！

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DSB修復檢測系統的原理

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DNA損傷的精準修復對于抑制遺傳不穩定和腫瘤發生至關重要。

真核生物主要通過兩種途徑修復：同源重組（HR）和非同源末端連接（NHEJ）。測量途徑的典型方法是盒式報告基因檢測。

同源重組修復檢測系統：

同源重組（HR）檢測系統由兩個突變的非功能性熒光蛋白SceGFP和iGFP組成，SceGFP和iGFP之間由藥物篩選標記嘌呤分離開。

SceGFP作為重組報告基因，序列中插入一個I-Sce I位點使其失活，當加入I-Sce I核酸內切酶時可以引起SceGFP斷裂，刺激修復途徑激活，以iGFP為供體片段的同源重組修復事件修復斷裂的SceGFP進而恢復熒光蛋白的表達。

非同源末端連接：

非同源末端連接（NHEJ）檢測系統包含一個啟動子、嘌呤抗性、GFP；

啟動子通過一個puro基因與GFP編碼盒分離，puro基因兩側是兩個具有相同方向的I-SceI位點，當加入I-Sce I核酸內切酶時，puro基因被切除，NHEJ修復兩個I-SceI誘導的DSB，I-SceI識別位點之間的末端連接可恢復GFP+表達。

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DSB修復檢測系統的應用案例

為研究NORAD如何影響輻射應激期間ESCC細胞的DNA損傷修復反應，在KYSE-150和TE-1細胞中敲低了NORAD。將重組DR-GFP質粒轉染到有和沒有NORAD敲低的細胞中，以確定NORAD是否調節DNA修復。通過將I-SceI質粒瞬時轉染到細胞中來誘導DNA雙鏈斷裂。流式細胞術測定顯示NORAD敲低導致DSB的同源重組修復減少3-4倍?；诹魇郊毎g的細胞凋亡測定表明，NORAD敲低提高了照射細胞的凋亡率。證實了NORAD通過調節DNA損傷修復過程來調節ESCC輻射敏感性。

常規實驗步驟：

首先，將DNA DSBs報告質粒轉染到細胞中，篩選穩定表達DR-GFP的細胞，并瞬時轉染另一個表達I-Sce I核酸內切酶的質粒。

ISceI轉染2-4天后，使用流式細胞術評估GFP陽性細胞的比例，并計算修復效率。

吉凱基因可以提供用于染色體斷裂修復檢測系統的質粒：

HR同源重組修復的pDRGFP 質粒；

NHEJ非同源末端修復的EJ5GFP質粒（EJ5-GFP檢測多類NHEJ事件，因此可以被認為是總NHEJ的測定）；

I-Sce I核酸內切酶的質粒。

如果您有其他檢測系統需求，也歡迎咨詢。