編者按
人腺病毒（HAdVs）是引起人體感染的主要原因之一，在嚴重兒童胃腸炎住院中，10%以上由HAdVs感染導致。HAdVs會感染多種黏膜，包括腸道、肺、眼睛，在感染后，NK細胞會作出應答，那么在這一過程中，有何關鍵蛋白起到了作用呢？相關研究又是否可以在類器官上進行呢？
今天，我們特別關注一項于2021年9月17日發表在《科學·免疫學》的研究——KIR3DS1 directs NK cell–mediated protection against human adenovirus infections，該研究利用腸道類器官與NK細胞進行共培養，研究了人體細胞抵御HAdVs的關鍵蛋白。
一、研究背景
人腺病毒（HAdV）是導致人類感染的主要原因之一[1]。不同血清型的HAdV可感染不同黏膜部位，包括腸道、肺部和眼睛。然而，幾乎所有血清型的HAdV都在腸道中復制，而腸道是 HAdV感染和再活化的主要部位。尤其是兒童和免疫力低下的人有可能患上嚴重的HAdV并發癥，在嚴重兒童胃腸炎住院中，10%以上由HAdVs感染導致。在小兒異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）后，HAdV再活化可能是一種威脅生命的疾病，以腸道炎癥、肝炎和呼吸衰竭為特征，導致8~26%的死亡率。
目前，尚缺乏針對HAdV且無嚴重不良反應的有效療法，這凸顯了臨床對新治療策略的需求。而最近的研究發現，自然殺傷（NK）細胞是幼兒腸道中最早出現的細胞毒性淋巴細胞。NK細胞也是異體HSCT后最先恢復并進入黏膜組織的細胞之一。因此，NK細胞可能可以提供抵御病毒感染的重要天然保護，并可用于治療嚴重的HAdV感染。
NK細胞識別HAdV感染的細胞取決于細胞表面配體的表達，尤其是人類白細胞抗原（HLA）分子。HAdV5編碼的免疫調節E3/糖蛋白19K（E3/19K），可與內質網中的HLA I類分子結合并將其留在內質網中，從而阻止HLA I類分子來到細胞表面，E3/19K還能抑制主要組織相容性復合體I類鏈相關蛋白A和B（MICA/B）的表面呈遞，進而避免NK細胞對其識別，實現免疫逃逸。然而，上述研究發現均來源于永生化的細胞系，惡性轉化會改變NK細胞免疫配體的基線表達譜，從而影響免疫識別，并使感染實驗的潛在結果與體內原代細胞的結果相比出現偏差。
此外，同種細胞系不能再現生理組織特有的細胞異質性。因而，基于原代人類上皮細胞的類器官技術為體外研究病毒感染提供了巨大的機會。因此，本研究利用人腸道類器官與NK細胞共培養的體系研究NK細胞識別及殺傷HAdV5的分子機制，為后續HAdV5感染的治療方案又提供了新的見解。
二、主要研究成果
1、腸道類器官模型可用于HAdV5感染研究
本研究利用人的回腸組織進行腸道類器官的構建，作者采取了兩種方法——基質膠支架法（MDM）和低吸附板懸浮法（無基質膠，SDM），然后對比這兩種培養方法下生長起來的腸道類器官的標志物表達，發現這兩者的表達沒有顯著差異（原文圖1A和B）。之前的文獻顯示，低吸附培養24~48 h會影響腸道類器官的極化，即使得腸道類器官出現內外翻轉，因此研究人員也對腸道類器官的細胞骨架和緊密連接蛋白進行了染色，結果顯示，低吸附培養確實使得腸道類器官出現了內外翻轉（原文圖1C）。
HAdV5進入細胞的主要受體為柯薩奇病毒-腺病毒受體（CXADR），腸道類器官的染色結果顯示，CXADR在頂側和基底側均有表達，但在基底側表達較少（原文圖1D）。為了評估腸道類器官的頂側或基底側暴露HAdV5是否影響感染動力學，研究人員利用HAdV5/mCherry病毒分別感染腸道類器官的基底側（MDM）或頂側（SDM），他們發現，兩種條件下均檢測到感染，但SDM下的感染情況更嚴重（原文圖1E），因此，研究人員將SDM培養的頂側暴露的腸道類器官作為后續的研究模型。
而此處用于可視化的HAdV5/mCherry毒株缺乏E3/19K，因此，研究人員利用流式細胞術檢測了腺病毒蛋白來評估E3/19K的免疫調節作用。他們利用野生型（WT）和E3/19K敲除（19Kstop）的HAdV5分別感染了腸道類器官，發現WT和19Kstop HAdV5感染的腸道類器官在感染后的4天內，腺病毒六鄰體蛋白陽性的感染細胞比例增加（原文圖1F），因此他們選擇感染3天為建模時長。
原文圖1 HAdV5可有效感染腸道類器官
2、HAdV5感染的腸道類器官中NK細胞表面活化性受體（NKG2D）的配體表達上調
NKG2D的配體（NKG2DL）在穩態時表達量較低，但在病毒感染時會上調，從而使NK細胞能夠識別被感染的細胞并進行殺傷。NKG2DL包括UL16結合蛋白（ULBP）和MICA/B，之前有研究表明它們會被E3/19K下調。
因此，本文作者評估了HAdV5感染對器官組織中NKG2DL表達的影響，結果顯示，未感染的細胞中，NKG2DL基線表達非常低，此外，從HAdV5感染的腸道類器官中分選出六鄰體蛋白陰性的細胞（未感染的細胞），NKG2DL的表達也沒有出現大幅波動；相反，從HAdV5感染的腸道類器官中分選出六鄰體蛋白陽性的細胞（已感染的細胞），NKG2DL的表達顯著升高（原文圖2A和B）。
原文圖2 HAdV5使腸道類器官中經典HLA I類分子的表達失調，并使NKG2D配體表達上調
3、HAdV5感染調控腸道類器官中經典HLA分子的表達
HLA I類分子對抗原呈遞及NK細胞的應答有著重要的作用，在WT HAdV5感染的腸道類器官中，全HLA I類分子的表達顯著降低，而在19Kstop HAdV5感染的類器官中，全HLA I類分子的表達顯著上調。HLA-A和HLA-B的表達變化是導致全HLA I類分子表達降低的主要原因，而HLA-C1/C2的表達變化較小，且不受19Kstop HAdV5的影響（原文圖2A和B）。利用HLA-A和HLA-B特異性抗體對腸道類器官進行HLA I類分型，證實是HLA-A和HLA-B分子的表達變化大（原文圖2A和C）。
4、HAdV5感染的腸道類器官中HLA-F的表達顯著上調，而且與E3/19K無關
近期的研究表明，一種非經典的HLA-I類分子HLA-F被鑒定為激活NK細胞受體KIR3DS1的主要配體，可促進機體對病毒的控制。因此，研究人員對HLA-F的表達也進行了檢測，他們發現，用Mock病毒感染（空白對照）的腸道類器官上皮細胞低表達HLA-F，而用HAdV5病毒感染的腸道類器官中：六鄰體陰性的上皮細胞不表達HLA-F，六鄰體陽性的上皮細胞顯著高表達HLA-F，并且這種HLA-F的表達差異與E3/K19無關（原文圖3A）。免疫熒光實驗也呈現出了同一結果（原文圖3B）。
原文圖3 HAdV5感染使腸道類器官上皮細胞中HLA-F的表達上調
5、HAdV5誘導的HLA-F表達上調可引起KIR3DS1+ NK細胞對感染細胞的特異性殺傷
為了確定HAdV5誘導的HLA-F上調是否導致了KIR3DS1+ NK細胞的有效識別，研究人員首先評估了KIR3DS1與HAdV5感染的上皮細胞的結合情況。HAdV5感染的類器官中六鄰體陽性細胞與可溶性KIR3DS1-Fc的結合顯著高于六鄰體陰性細胞和空白對照組，用抗HLA-F抗體阻斷后，KIR3DS1-Fc結合情況顯著降低（原文圖4A）。
KIR3DS1+ Jurkat報告基因細胞（J3DS1+）轉導了融合在CD3胞質區的KIR3DS1受體嵌合體結構，在該細胞中，HLA-F結合引起受體交聯，導致活化標志物CD69上調。將J3DS1+和未轉染的Jurkat細胞（J3DS1-）與未感染和WT HAdV5感染的類器官培養的上皮細胞共孵育。與未感染HAdV5的細胞相比，感染HAdV5的細胞中CD69+ J3DS1+細胞的比例顯著增加（原文圖4B）。
接下來，研究人員評估了原代NK細胞對HAdV5感染的上皮細胞的功能反應。將HAdV5感染的3D類器官的上皮細胞與原代人NK細胞共孵育，與來自同一供體的KIR3DS1- NK細胞相比，KIR3DS1+ NK細胞表現出更高的HAdV5誘導的CD107a（NK細胞脫顆粒的標志物）表達（原文圖4C）。NK細胞介導的病毒控制是通過殺傷病毒感染的細胞來實現的。
因此，研究人員將同一供體的外周血單核細胞中的KIR3DS1+和KIR3DS1- NK細胞分選出來，并與未感染和HAdV5感染的類器官上皮細胞共培養。結果顯示，KIR3DS1+ NK細胞對HAdV5感染的上皮細胞的特異性殺傷能力顯著高于KIR3DS1- NK細胞，表現為LDH釋放的增加（原文圖4D），表明KIR3DS1+ NK細胞具有更強的殺傷能力。
研究人員還對兒童allo-HSCT的大型隊列進行了比較分析，他們發現，與其他所有基因型（非KIR3DS1+/HLA-Bw4+）的供者相比，KIR3DS1+/HLA-Bw4+基因型的供體細胞的受者發生高HAdV病毒血癥的風險較低（原文圖4E）。
原文圖4 KIR3DS1+ NK細胞具有更強的殺傷HAdV5感染的上皮細胞的能力，接受KIR3DS1+/HLA-Bw4+ allo-HSCT的患兒嚴重的腺病毒血癥減少
三、編者點評
本文利用正常的腸道類器官與NK細胞共培養的多細胞模型，加上病毒感染，模擬了體內的病毒免疫應答情況，為后續的免疫相關研究提供了一個有力的簡化模型，具有較大創新性。
本文的發現：HAdV感染細胞表達的KIR3DS1與HLA-F之間存在相互作用，可以為兒童allo-HSCT后HAdV再激活患者或先天性免疫缺陷患者提供新的免疫治療選擇，從而為兒童疾病的新型治療方案開發提供了研發方向。
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