KRAS是人類癌癥中最常見的突變癌基因之一，約占所有腫瘤的15%~20%，是肺癌、結直腸癌、胰腺癌等高死亡率腫瘤的重要癌驅動基因。由于KRAS下游信號通路的復雜代償及反饋調節，因此針對KRAS突變的腫瘤仍無有效的治療手段。
中國科學院上海藥物研究所研究員譚敏佳和研究員黃敏團隊合作在《Molecular Cell》（中科院JCR一區，IF:17.970）上發表了題為“A proteomic and phosphoproteomic landscape of KRAS mutant cancers identifies combination therapies”的研究論文。研究開展了大規模腫瘤細胞樣本的蛋白質組學檢測，全景描繪了KRAS突變腫瘤的蛋白質組和磷酸化信號通路，實現了基于多組學的KRAS突變腫瘤的分子分型，并在此基礎上揭示了KRAS突變腫瘤的精準治療新策略。
蛋白組學和磷酸化蛋白組學鑒定結果
作者對43種KRAS突變和10種KRAS野生型（KRAS WT）的癌細胞系進行了蛋白組學和磷酸化蛋白組學檢測。最終檢測到超過 14500個蛋白質和超過 5600個磷酸化蛋白質及19700個磷酸化肽段。43種KRAS突變來自胰腺腺癌(PAAD)、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸腺癌（COAD/READ）、乳腺浸潤癌(BRCA)、胃腺癌(STAD)、宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌(CESC)以及膀胱尿路上皮癌(BLCA)。
KRAS突變癌細胞的分子亞型及特征
來自癌癥藥物敏感性基因組學(GDSC)數據庫的公開轉錄組數據，以及此次實驗的蛋白組學和磷酸化蛋白組學，無監督聚類產生了3個亞型：S1、S2和S3。三個KRAS亞型的KRAS突變類型和拷貝數變異(CNV)， 除了G12C突變富集在S1 ，其他亞群之間沒有統計學上的顯著差異。研究者使用隨機森林學習方法提取了最重要的分子特征來區分亞型，共確定了16種蛋白質、8種磷酸化蛋白或21種mRNA分別作為蛋白質、磷酸化蛋白或mRNA水平的分子分型標志物?；?1個特征mRNA對TCGA數據庫中507個KRAS突變的臨床樣本進行非監督聚類分析，將KRAS突變腫瘤病人分為預后顯著差異的三個亞型，證實了本研究發現的分子分型具有顯著的臨床意義。
生信分析揭示KRAS突變亞型中獨特的分子特征
基因集富集分析(GSEA)表明，S2顯示出明顯高于其他兩個亞型的致癌信號通路富集，這可能解釋了驅動基因突變頻率最低的相應T2患者最差的臨床結局。S1在mRNA水平上顯示了細胞周期相關途徑的富集，以及在mRNA和蛋白質水平上的EMT和MYC途徑。S2顯示了KRAS和炎癥反應途徑的富集。在S3中，富集了最少的通路，這可能部分解釋了S3患者的最佳預后。
為了識別功能上重要的亞群特異性磷酸化，作者從PhosphoSitePlus數據庫中檢索了所有功能注釋的磷酸化位點。與S3相比，S1或S2中出現了參與細胞凋亡抑制、細胞生長和細胞運動的較高水平的磷酸化位點，以及參與細胞凋亡誘導、細胞分化和轉錄抑制的較低水平的磷酸化位點。激酶-底物富集分析發現，細胞周期蛋白依賴性激酶CDK5和CDK2在S1富集，而RTK，如EGFR和MET，以及非受體酪氨酸激酶ABL1在S2富集。這一結果可能部分解釋了這三個亞型之間差異激活的信號通路。
KRAS突變癌癥的亞型特異性治療藥物
為了進一步確定亞組特異性療法及其分子指標，研究者分析了藥物-蛋白質和藥物-磷酸化位點的相關性。共確定了與MEKi、ERKi或AKTi這幾類藥物敏感性高度相關的幾種常見蛋白質和磷酸化位點。在高度相關的蛋白質中，發現了多種亞型特異性的癌癥依賴基因。此外，研究者分析了亞型特異性藥物療法，包括針對S1亞型的7種藥物、針對S2亞型的1種藥物和針對S3亞型的4種藥物。
磷酸化蛋白組分析發現了治療KRAS突變癌癥的藥物組合
KRAS突變激活多個下游途徑。先前的研究表明，阻斷單個下游途徑幾乎不能獲得治療益處，這表明突變型癌癥治療的靶向信號補償的可能性。因此，研究者提出了一個假設，即兩種對同一組磷酸化蛋白顯示大量反向相關性的藥物可能有更高的機會顯示協同效應，特別是當這些磷酸化蛋白在KRAS突變癌癥中被共同激活時。
為了驗證這一假設，研究者進行了一項補償性磷酸化蛋白生物標志物分析(CPBA)，最終共獲得了41種藥物組合。所有藥物組合在S2亞型中通過了共激活分析，在S3亞型中通過了五種藥物組合，而在S1亞型中沒有藥物組合通過。已確定的藥物組合，包括MEK和SHP2的聯合抑制劑以及MET和VEGFR的聯合抑制劑，已被報道顯示出對KRAS突變型癌癥有很好的治療效果。研究者進一步測試了五種新的藥物組合，與任一單一療法相比，所有藥物組合在KRAS突變的PANC-03-27細胞中顯示出顯著更強的反應。在兩個S2型細胞(PANC-02-03和NCI-H1373) 使用多劑量，進一步證實了這些藥物組合的協同作用。這些結果表明，CPBA可能是一個有用的方法來預測藥物組合對KRAS突變癌癥的療效。
DOT1L和SHP2聯合抑制可以特異性治療S2亞型的KRAS突變腫瘤
研究者關注到了靶向DOT1L和SHP2的抑制劑組合。DOT1Li-SHP2i組合之間的協同作用通過測量劑量依賴性反應得到證實。兩種額外的DOT1L抑制劑，EPZ-5676和EPZ004777或同時敲除DOT1L和編碼SHP2蛋白的PTPN11也得到了相似的結果。CPBA表明，DOT1Li-SHP2i組合具有治療S2腫瘤的潛力，DOT1Li-SHP2i組合在S2亞型的KRAS突變腫瘤細胞系中引起了更強的抗腫瘤反應。此外，異種移植瘤模型實驗也表明，DOT1Li-SHP2i組合能更有效地抑制S2亞型KRAS突變癌細胞系生長。以上結果表明，DOT1L和SHP2抑制劑的聯用在治療S2亞型的KRAS突變腫瘤中的潛在應用。
DOT1Li-SHP2i聯合治療獲益的分子基礎研究
對用DOT1L抑制劑處理的癌細胞進行了RNA測序，結果顯示了KRAS相關信號的上調、MAPK和PI3K/AKT上調。而與SHP2抑制劑聯合治療降低了MAPK信號而非AKT信號。在未能從DOT1Li-SHP2i組合治療中獲益的細胞系中，MAPK和AKT途徑都沒有被DOT1L抑制上調。這些發現表明DOT1Li-SHP2i組合的治療益處與MAPK通路的上調有關。
研究者進一步研究了DOT1L抑制引起的MAPK途徑的上調是否表明對該途徑的生長依賴性增加。結果表明，用DOT1Li預處理，然后用SHP2i處理，導致細胞生長顯著減少。然而，兩種藥物以相反的順序治療幾乎沒有抗增殖作用。異種移植瘤小鼠實驗得到了同樣的結果。這些結果共同表明DOT1Li增強了對MAPK途徑的生長依賴性，并導致對SHP2抑制劑的易感性。
抑制DOT1L引起MAPK/AKT通路的反饋上調的機制研究
研究者檢測了DOT1L抑制后的腫瘤細胞的蛋白質組變化。49個基因在蛋白質組和RNA-seq數據中均上調。在前五名候選基因中，只有PREX1的轉錄水平在響應細胞和非響應細胞之間有顯著差異。PREX1與MAPK和AKT通路相關，這是KRAS的典型下游通路。敲除PREX1可以消除DOT1L抑制對MAPK/AKT通路上調的影響。進一步的機制研究發現，DOT1L抑制導致PREX1基因啟動子H3K79甲基化下降和H3K79乙?；@著增加。綜上所述，這些結果表明DOT1Li誘導的H3K79甲基化缺失可以促進PREX1基因位點上的H3K79乙酰化，促進PREX1表達和MAPK/AKT信號的反饋激活。這些變化增加了細胞生長對MAPK/AKT信號傳導的依賴，并對SHP2/ERK或AKT抑制劑產生反應。
研究總結
本研究對43種不同組織來源的KRAS突變癌細胞系進行了蛋白質組學和磷酸化蛋白組學檢測，并結合公共轉錄組數據分析，將KRAS突變的癌細胞分為三個亞型：S1、S2和S3。同時，分別從mRNA水平、蛋白水平和磷酸化蛋白水平找到了特征分子。利用補償的磷酸化蛋白質組生物標志物分析（CPBA）鑒定到了相當數量的藥物對可能對治療KRAS突變腫瘤有效。其中，對DOT1L和SHP2聯合抑制的藥物組合對S2亞型的KRAS突變癌細胞表現出了最好的抗腫瘤效果。機制上，DOT1L抑制誘導的組蛋白乙酰化增加了PREX1的轉錄，并導致MAPK和AKT信號的反饋激活，從而對SHP2/ERK或AKT抑制劑產生反應。
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