題目：A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging
期刊：Nature Communation
影響因子：12.124
主要技術：CRISPR-Cas9
研究背景
CRISPR-Cas9技術雖然使基因敲除變得簡便，但標簽插入依然由于每插入一個位點都需要針對該位點構建donor質粒且依賴自發的同源重組而顯得昂貴且存在一定難度。本研究發現了一種能解決上述問題的基因標簽插入方法，該方法只需構建一個donor質粒即可用于所有位點的精準的標簽插入且不依賴于同源重組。
研究內容及結果
1. 本研究首先構建了能表達斑馬魚tia1l基因sgRNA的donor質粒，該質粒在Cas9蛋白的存在下能釋放殺稻瘟菌素CDS，與攜帶Cas9蛋白和特定位點sgRNA的質粒共轉入大多數基因都只有1個拷貝的HAP1細胞中，初步評估了殺稻瘟菌素CDS插入的效率，6個基因12個位點中有11個成功插入了殺稻瘟菌素CDS。
期刊：Nature Communation
影響因子：12.124
主要技術：CRISPR-Cas9
研究背景
CRISPR-Cas9技術雖然使基因敲除變得簡便，但標簽插入依然由于每插入一個位點都需要針對該位點構建donor質粒且依賴自發的同源重組而顯得昂貴且存在一定難度。本研究發現了一種能解決上述問題的基因標簽插入方法，該方法只需構建一個donor質粒即可用于所有位點的精準的標簽插入且不依賴于同源重組。
研究內容及結果
1. 本研究首先構建了能表達斑馬魚tia1l基因sgRNA的donor質粒，該質粒在Cas9蛋白的存在下能釋放殺稻瘟菌素CDS，與攜帶Cas9蛋白和特定位點sgRNA的質粒共轉入大多數基因都只有1個拷貝的HAP1細胞中，初步評估了殺稻瘟菌素CDS插入的效率，6個基因12個位點中有11個成功插入了殺稻瘟菌素CDS。
2.對上述篩選到的成功插入殺稻瘟菌素CDS的細胞進行克隆分離并檢測發現，12個單克隆中有11個是在PAM位點前3個堿基處精確插入殺稻瘟菌素CDS。
3.qPCR檢測野生HAP1細胞中分別用IFNβ、Activin A、FGF1誘導0、4、8、24h后，IFIT1、DACT1、EGR1的表達了均上調。將NanoLuc報告基因分別插入IFIT1、DACT1、EGR1，加入誘導劑后 IFIT1、DACT1、EGR1的表達量均上調。NanoGlo熒光素酶檢測結果與qPCR結果一致，表明本研究中使用的標簽插入方法能用來監控內源基因的表達。
4.運用上述的標簽插入方法在HAP1細胞內源基因LMNA、TERF1、LAMP1中插入熒光標記基因TurboGFP并用流式細胞術富集成功插入標簽的細胞，以用于活細胞成像研究，可以對目標基因表達產物進行精準定位。
文章小結
運用本研究中的標簽插入方法，可以對目標細胞系靶基因定點插入NanoLuc、TurboGFP或其他標簽，實現對靶基因表達量的監控或進行亞細胞定位。該方法比傳統的依賴于同源重組雙交換的標簽插入方法更加省時，操作上更為便捷，且一個donor載體可以用于不同基因不同細胞的同一種標簽插入，節約成本。
解析文獻
Daniel H. Lackner, Alexia Carre′, et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging [J]. Nature Communications,2015,6:10237.
參考文獻
1.Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P. & Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homologyindependent DNA repair. Genome Res. 24, 142–153 (2014).
2. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N. & Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Res. 23, 539–546(2013).
3. Cristea, S. et al. In vivo cleavage of transgene donors promotes nucleasemediated targeted integration. Biotechnol. Bioeng. 110, 871–880 (2013).
4. Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186–191 (2015).
5. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823 (2013).
運用本研究中的標簽插入方法，可以對目標細胞系靶基因定點插入NanoLuc、TurboGFP或其他標簽，實現對靶基因表達量的監控或進行亞細胞定位。該方法比傳統的依賴于同源重組雙交換的標簽插入方法更加省時，操作上更為便捷，且一個donor載體可以用于不同基因不同細胞的同一種標簽插入，節約成本。
解析文獻
Daniel H. Lackner, Alexia Carre′, et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging [J]. Nature Communications,2015,6:10237.
參考文獻
1.Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P. & Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homologyindependent DNA repair. Genome Res. 24, 142–153 (2014).
2. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N. & Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Res. 23, 539–546(2013).
3. Cristea, S. et al. In vivo cleavage of transgene donors promotes nucleasemediated targeted integration. Biotechnol. Bioeng. 110, 871–880 (2013).
4. Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186–191 (2015).
5. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823 (2013).