近年來，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通過病毒載體已成為操控神經(jīng)元及其電路活動(dòng)的研究重點(diǎn)。其中，重組腺相關(guān)病毒（AAV）載體在光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)等尖端技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。雖然在向目標(biāo)神經(jīng)元群體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面取得了可觀進(jìn)展，但不同的AAV血清型表現(xiàn)出不同的感染特性。在靈長類動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物大腦的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，常用AAV1、AAV5和AAV9載體。然而，這些載體在對(duì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞感染時(shí)，可能引發(fā)炎癥反應(yīng)。相比之下，AAV2表現(xiàn)出較高的神經(jīng)元特異性，但其轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力較低。因此，需要一種在轉(zhuǎn)基因表達(dá)和神經(jīng)元特異性方面都具有優(yōu)越性的AAV載體。
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京都大學(xué)靈長類研究所和人類行為進(jìn)化起源中心的研究者們開發(fā)了一種由AAV1和AAV2的外殼蛋白組成的鑲嵌載體，名為AAV2.1載體，旨在實(shí)現(xiàn)同時(shí)的高轉(zhuǎn)基因表達(dá)和神經(jīng)元特異性。通過與原始AAV2和AAV1載體進(jìn)行比較，研究分析了AAV2.1載體在獼猴前額皮層中的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。此外，還探討了AAV2.1載體在紋狀體和視覺皮層中進(jìn)行化學(xué)遺傳學(xué)操作和體內(nèi)鈣成像方面的應(yīng)用。研究成果以“A mosaic adeno-associated virus vector as a versatile tool that exhibits high levels of transgene expression and neuron specificity in primate brain”為題，發(fā)表在Nature Communications（IF：17.694）上。
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研究 結(jié)果
1.?制備鑲嵌式AAV載體
研究者們制備了兩種不同比例的鑲嵌式AAV載體其中包含不同比例的AAV1和AAV2外殼蛋白：AAV2.1-A載體，其外殼由10% AAV1外殼蛋白和90% AAV2外殼蛋白組成；以及AAV2.1-B載體，其外殼由50% AAV1外殼蛋白和50% AAV2外殼蛋白組成。根據(jù)之前的體外研究，最初制備了AAV2.1-B載體，但發(fā)現(xiàn)存在一定程度的膠質(zhì)感染性。因此，隨后制備了AAV2.1-A載體，其中AAV1外殼蛋白的比例降低到10%。在三組實(shí)驗(yàn)中使用了14種不同的載體，包括基因轉(zhuǎn)導(dǎo)特性的形態(tài)學(xué)分析、神經(jīng)元活動(dòng)的化學(xué)遺傳學(xué)調(diào)制，以及神經(jīng)元活動(dòng)的體內(nèi)鈣成像。結(jié)果顯示，AAV2.1和AAV1載體的效率普遍高于AAV2載體。
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2.鑲嵌式AAV載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)特性
研究者首先通過將拼接式AAV2.1-A和AAV2.1-B載體與原始的AAV2和AAV1載體進(jìn)行比較，探究了它們的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。研究中使用了廣泛表達(dá)的CMV啟動(dòng)子和神經(jīng)元特異性的Syn啟動(dòng)子，分別評(píng)估了載體的神經(jīng)元特異性和神經(jīng)元內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。在兩只恒河猴的額葉中央壁注射了八種不同類型的攜帶mKO1基因的AAV載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AAV2.1-A載體在神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生了更高水平的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，無論是在轉(zhuǎn)基因表達(dá)強(qiáng)度還是神經(jīng)元數(shù)量方面。與其他載體相比，它展現(xiàn)出了更高的神經(jīng)元特異性。
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然后探究了拼接式AAV2.1-A和AAV2.1-B載體與原始AAV2和AAV1載體之間的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)特性以及神經(jīng)元特異性。研究使用了不同類型的啟動(dòng)子評(píng)估了這些載體在神經(jīng)元內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和神經(jīng)元特異性。結(jié)果顯示，AAV2.1-A載體表現(xiàn)出最高效和最神經(jīng)元特異性的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，其神經(jīng)元特異性甚至超過了AAV2載體，而AAV2.1-B載體在膠質(zhì)感染性方面接近AAV1載體。然而，考慮到載體的膠質(zhì)感染性，一些情況下轉(zhuǎn)基因表達(dá)的信號(hào)可能不僅來自神經(jīng)元，還來自膠質(zhì)細(xì)胞。
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進(jìn)一步比較了AAV2.1-A載體與AAV5和AAV9載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。在實(shí)驗(yàn)中，我們注射了不同組合包膜的AAV-CMV-mKO1載體（AAV2.1-A、AAV1、AAV5和AAV9）以及具有相同病毒顆粒的AAV-Syn-mKO1載體到猴子的前額中央皮層。結(jié)果顯示，AAV2.1-A載體在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力方面與AAV9載體相當(dāng)，并在一些方面超越了AAV5載體。這些發(fā)現(xiàn)表明AAV2.1-A載體在大腦研究中具有潛在的優(yōu)勢。
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隨后，分析了AAV5和AAV9載體與AAV2.1-A和AAV1載體的神經(jīng)元特異性。結(jié)果顯示，AAV2.1-A載體表現(xiàn)出最高的神經(jīng)元特異性，而AAV5和AAV9載體則在一定程度上存在膠質(zhì)感染。使用Syn啟動(dòng)子的載體幾乎實(shí)現(xiàn)了完美的神經(jīng)元特異性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。
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為了驗(yàn)證AAV2.1-A載體在嚙齒動(dòng)物大腦中的優(yōu)越性是否適用于大腦，將其與AAV1、AAV2、AAV5和AAV9載體在大鼠大腦皮層中的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)特性進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，AAV2.1-A和AAV9載體在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)水平上表現(xiàn)出相似的高效率，且與AAV1、AAV2和AAV5載體相比，AAV2.1-A載體以及AAV2載體表現(xiàn)出更高的神經(jīng)元特異性。
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3. AAV2.1-A載體在化學(xué)遺傳學(xué)操控方面的應(yīng)用
其次，研究者使用AAV2.1-A-Syn載體在大腦中進(jìn)行化學(xué)遺傳學(xué)調(diào)控實(shí)驗(yàn)。通過將修飾的人類M3毒蕈堿受體（hM3Dq）基因載入該載體，并在兩只獼猴的紋狀體注射，探索了受體結(jié)合、配體響應(yīng)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)性等特性。與原始AAV2和AAV1載體進(jìn)行比較，制備了不同的載體并應(yīng)用不同的啟動(dòng)子，評(píng)估其在興奮性DREADDs系統(tǒng)中的效能。
在第一只猴子中，將AAV2.1-A載體與AAV2載體進(jìn)行比較，研究了其在DREADDs系統(tǒng)中的應(yīng)用。注射了高度神經(jīng)元特異性的載體，包括AAV2.1-A-Syn載體和其他類型的AAV載體，以評(píng)估DREADDs受體結(jié)合能力、配體響應(yīng)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)性。結(jié)果顯示，AAV2.1-A載體在[11C]DCZ結(jié)合（hM3Dq表達(dá)）和[18F]FDG攝取方面均表現(xiàn)出優(yōu)越性，持續(xù)時(shí)間長達(dá)六個(gè)月以上。
在第二只猴子中，將四種類型的載體注射到紋狀體，通過[11C]DCZ-PET和[18F]FDG-PET掃描，比較了AAV2.1-A載體與傳統(tǒng)AAV2和AAV1載體的效果。結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)上，這些載體均展現(xiàn)出類似的高水平的[11C]DCZ結(jié)合和[18F]FDG攝取，持續(xù)時(shí)間達(dá)一年以上。
這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AAV2.1-A載體在神經(jīng)元活動(dòng)的化學(xué)遺傳學(xué)調(diào)控中具有優(yōu)越性，為進(jìn)一步的腦科學(xué)研究提供了有力工具。
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通過PET成像和免疫組織化學(xué)分析，證實(shí)了AAV2.1-A載體在紋狀體中的神經(jīng)元特異性表達(dá)。[11C]DCZ-PET成像顯示hM3Dq表達(dá)與GFP陽性區(qū)域相符。DCZ處理后，AAV2.1-A載體在紋狀體注射點(diǎn)表達(dá)c-fos的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加。該載體偏向于從細(xì)胞體和樹突攝取，同時(shí)在投射神經(jīng)元和抑制神經(jīng)元中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。
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4.?AAV2.1-A載體在體內(nèi)鈣成像中的應(yīng)用
研究者使用融合載體進(jìn)行光學(xué)成像研究，發(fā)現(xiàn)在猴子大腦皮層中可以穩(wěn)定地監(jiān)測神經(jīng)元活動(dòng)。這種載體產(chǎn)生高度選擇性的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，對(duì)于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞具有高度特異性。同時(shí)，它在神經(jīng)元中產(chǎn)生持久且穩(wěn)定的熒光信號(hào)，可以長期監(jiān)測活動(dòng)。這為研究靈長類大腦的功能提供了有力工具。
研究 總結(jié)
這篇文章探討了一種新型的病毒載體，用于在靈長類動(dòng)物的大腦中實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)元活動(dòng)監(jiān)測。研究通過比較不同載體的特性，發(fā)現(xiàn)這種稱為AAV2.1-A的載體在猴子和老鼠大腦中具有高度的神經(jīng)元特異性和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力。這種載體不僅對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生持久的熒光信號(hào)，還可以在激活神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的信號(hào)。因此，這項(xiàng)研究為深入理解靈長類大腦功能提供了有力的工具和方法。