近年來，基因轉導通過病毒載體已成為操控神經元及其電路活動的研究重點。其中，重組腺相關病毒（AAV）載體在光遺傳學和化學遺傳學等尖端技術中得到廣泛應用。雖然在向目標神經元群體進行基因轉導方面取得了可觀進展，但不同的AAV血清型表現出不同的感染特性。在靈長類動物和嚙齒動物大腦的基因轉導實驗中，常用AAV1、AAV5和AAV9載體。然而，這些載體在對神經元和膠質細胞感染時，可能引發炎癥反應。相比之下，AAV2表現出較高的神經元特異性，但其轉基因表達能力較低。因此，需要一種在轉基因表達和神經元特異性方面都具有優越性的AAV載體。
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京都大學靈長類研究所和人類行為進化起源中心的研究者們開發了一種由AAV1和AAV2的外殼蛋白組成的鑲嵌載體，名為AAV2.1載體，旨在實現同時的高轉基因表達和神經元特異性。通過與原始AAV2和AAV1載體進行比較，研究分析了AAV2.1載體在獼猴前額皮層中的基因轉導特性。此外，還探討了AAV2.1載體在紋狀體和視覺皮層中進行化學遺傳學操作和體內鈣成像方面的應用。研究成果以“A mosaic adeno-associated virus vector as a versatile tool that exhibits high levels of transgene expression and neuron specificity in primate brain”為題，發表在Nature Communications（IF：17.694）上。
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研究 結果
1.?制備鑲嵌式AAV載體
研究者們制備了兩種不同比例的鑲嵌式AAV載體其中包含不同比例的AAV1和AAV2外殼蛋白：AAV2.1-A載體，其外殼由10% AAV1外殼蛋白和90% AAV2外殼蛋白組成；以及AAV2.1-B載體，其外殼由50% AAV1外殼蛋白和50% AAV2外殼蛋白組成。根據之前的體外研究，最初制備了AAV2.1-B載體，但發現存在一定程度的膠質感染性。因此，隨后制備了AAV2.1-A載體，其中AAV1外殼蛋白的比例降低到10%。在三組實驗中使用了14種不同的載體，包括基因轉導特性的形態學分析、神經元活動的化學遺傳學調制，以及神經元活動的體內鈣成像。結果顯示，AAV2.1和AAV1載體的效率普遍高于AAV2載體。
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2.鑲嵌式AAV載體的基因轉導特性
研究者首先通過將拼接式AAV2.1-A和AAV2.1-B載體與原始的AAV2和AAV1載體進行比較，探究了它們的基因轉導特性。研究中使用了廣泛表達的CMV啟動子和神經元特異性的Syn啟動子，分別評估了載體的神經元特異性和神經元內的轉基因表達水平。在兩只恒河猴的額葉中央壁注射了八種不同類型的攜帶mKO1基因的AAV載體。實驗結果顯示，AAV2.1-A載體在神經元內產生了更高水平的基因轉導，無論是在轉基因表達強度還是神經元數量方面。與其他載體相比，它展現出了更高的神經元特異性。
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然后探究了拼接式AAV2.1-A和AAV2.1-B載體與原始AAV2和AAV1載體之間的基因轉導特性以及神經元特異性。研究使用了不同類型的啟動子評估了這些載體在神經元內的轉基因表達水平和神經元特異性。結果顯示，AAV2.1-A載體表現出最高效和最神經元特異性的基因轉導，其神經元特異性甚至超過了AAV2載體，而AAV2.1-B載體在膠質感染性方面接近AAV1載體。然而，考慮到載體的膠質感染性，一些情況下轉基因表達的信號可能不僅來自神經元，還來自膠質細胞。
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進一步比較了AAV2.1-A載體與AAV5和AAV9載體的基因轉導特性。在實驗中，我們注射了不同組合包膜的AAV-CMV-mKO1載體（AAV2.1-A、AAV1、AAV5和AAV9）以及具有相同病毒顆粒的AAV-Syn-mKO1載體到猴子的前額中央皮層。結果顯示，AAV2.1-A載體在基因轉導能力方面與AAV9載體相當，并在一些方面超越了AAV5載體。這些發現表明AAV2.1-A載體在大腦研究中具有潛在的優勢。
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隨后，分析了AAV5和AAV9載體與AAV2.1-A和AAV1載體的神經元特異性。結果顯示，AAV2.1-A載體表現出最高的神經元特異性，而AAV5和AAV9載體則在一定程度上存在膠質感染。使用Syn啟動子的載體幾乎實現了完美的神經元特異性基因轉導。
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為了驗證AAV2.1-A載體在嚙齒動物大腦中的優越性是否適用于大腦，將其與AAV1、AAV2、AAV5和AAV9載體在大鼠大腦皮層中的基因轉導特性進行了比較。結果顯示，AAV2.1-A和AAV9載體在基因轉導水平上表現出相似的高效率，且與AAV1、AAV2和AAV5載體相比，AAV2.1-A載體以及AAV2載體表現出更高的神經元特異性。
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3. AAV2.1-A載體在化學遺傳學操控方面的應用
其次，研究者使用AAV2.1-A-Syn載體在大腦中進行化學遺傳學調控實驗。通過將修飾的人類M3毒蕈堿受體（hM3Dq）基因載入該載體，并在兩只獼猴的紋狀體注射，探索了受體結合、配體響應和轉基因表達持續性等特性。與原始AAV2和AAV1載體進行比較，制備了不同的載體并應用不同的啟動子，評估其在興奮性DREADDs系統中的效能。
在第一只猴子中，將AAV2.1-A載體與AAV2載體進行比較，研究了其在DREADDs系統中的應用。注射了高度神經元特異性的載體，包括AAV2.1-A-Syn載體和其他類型的AAV載體，以評估DREADDs受體結合能力、配體響應和轉基因表達持續性。結果顯示，AAV2.1-A載體在[11C]DCZ結合（hM3Dq表達）和[18F]FDG攝取方面均表現出優越性，持續時間長達六個月以上。
在第二只猴子中，將四種類型的載體注射到紋狀體，通過[11C]DCZ-PET和[18F]FDG-PET掃描，比較了AAV2.1-A載體與傳統AAV2和AAV1載體的效果。結果顯示，在不同時間點上，這些載體均展現出類似的高水平的[11C]DCZ結合和[18F]FDG攝取，持續時間達一年以上。
這些實驗結果表明，AAV2.1-A載體在神經元活動的化學遺傳學調控中具有優越性，為進一步的腦科學研究提供了有力工具。
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通過PET成像和免疫組織化學分析，證實了AAV2.1-A載體在紋狀體中的神經元特異性表達。[11C]DCZ-PET成像顯示hM3Dq表達與GFP陽性區域相符。DCZ處理后，AAV2.1-A載體在紋狀體注射點表達c-fos的神經元數量顯著增加。該載體偏向于從細胞體和樹突攝取，同時在投射神經元和抑制神經元中表達轉基因。
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4.?AAV2.1-A載體在體內鈣成像中的應用
研究者使用融合載體進行光學成像研究，發現在猴子大腦皮層中可以穩定地監測神經元活動。這種載體產生高度選擇性的轉基因表達，對于神經元和膠質細胞具有高度特異性。同時，它在神經元中產生持久且穩定的熒光信號，可以長期監測活動。這為研究靈長類大腦的功能提供了有力工具。
研究 總結
這篇文章探討了一種新型的病毒載體，用于在靈長類動物的大腦中實現基因轉導和神經元活動監測。研究通過比較不同載體的特性，發現這種稱為AAV2.1-A的載體在猴子和老鼠大腦中具有高度的神經元特異性和穩定的轉基因表達能力。這種載體不僅對神經元產生持久的熒光信號，還可以在激活神經元活動時產生穩定的信號。因此，這項研究為深入理解靈長類大腦功能提供了有力的工具和方法。