編者按
由于種間差異，依賴動物試驗來預測藥物的臨床療效、毒理學等，會造成難以避免的預測偏差，最終導致大量藥物開發失敗。因此，開發能夠準確評估和預測候選藥物對人肝組織毒性和療效的體外肝臟細胞模型迫在眉睫。源于人多能干細胞的人肝臟類器官(HLO)為此提供了一種潛在的解決方案。
今天，我們特別關注一項中國科學院上海營養與健康研究所丁秋蓉研究團隊于2023年3月發表在《Cell Regeneration》的研究——《Modeling drug-induced liver injury and screening for anti-hepatofibrotic compounds using human PSC-derived organoids》，該研究將人多能干細胞衍生的肝臟類器官作為了學術研究和個性化醫療的臨床前模型，通過誘導人多能干細胞定向分化，構建HLO作為藥物性肝損傷模型，并用于篩選抗肝纖維化化合物，并揭示出HLO在藥物安全性測試和抗纖維化藥物篩選中的潛在應用。
論文翻譯：張凈月
01、研究背景
新藥研發的高失敗率，主要原因是嚴重依賴動物實驗獲得的臨床前數據。許多研究證明了人體特有的生物過程，無法用動物模型來模擬。例如，人和動物的肝臟細胞色素P450（CYP）酶不同[1]，因此動物對有毒物質的敏感性與人類不同。最近的一項研究首次比較了動物和人類研究中的靶器官毒性，也發現了人類和動物之間藥物誘發肝損傷（DILI）的一致性較低[2]。由于人體模型與動物模型之間缺乏生理相關性，因此迫切需要開發源于人體的體外細胞模型來研究藥物的毒性和療效。
最近報道了由多能干細胞（PSCs）產生的人類肝臟類器官（HLOs），其中包括多種細胞類型，包括肝細胞、肝星狀細胞和kupffer細胞[3]。這些HLOs能夠模擬游離脂肪酸治療或某些基因的遺傳突變誘導的脂肪性肝炎以及藥物誘導的膽汁淤積癥[4]。因此作者用已知可引起不同表型的DILI的化合物處理HLOs，并證明了HLOs在人類風險評估中的作用。并進一步設計了一種用于纖維化分析的高內涵分析（HCA）系統，并開發了一種使用HLOs的高通量抗纖維化藥物篩選系統。綜上所述，作者的研究表明，HLOs可以應用于DILI造模和藥物篩選。
02、主要研究成果
1、hPSC衍生的人肝類器官的功能表征
作者參照之前的方案[3][4]將hPSC誘導為HLO：hPSCs最初分化成前腸球體，然后用視黃酸（RA）進行3D培養，以實現實質細胞和非實質細胞的分化，接著在肝臟成熟培養基中進一步培養。另外，前腸細胞也可以用Accutase分散成單細胞，然后在由成纖維細胞生長因子2（FGF2）、血管內皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）、CHIR99021（糖原合酶激酶3抑制劑）和A83-01（轉化生長因子-β抑制劑）與抗壞血酸等5種因子組成的培養基（稱為“5F”法）中擴增，再進行RA處理和進一步培養。
此外，白蛋白分泌和幾個肝臟標記基因（ALB、CYP3A4、CYP2B6、CYP2E1）的表達水平分析表明，5F法衍生的HLOs含有更多成熟的肝細胞。膽管細胞標記物（SOX9）和星狀細胞標記物（PDGFRβ）的免疫熒光分析進一步證明了HLOs中存在多種細胞類型。
原文圖1 來源于hPSC的人肝類器官的功能表
2、使用HLO對具有不同表型的DILI進行建模
作者為了進一步評估這些HLOs是否可以用于模擬不同毒素引起的DILI，因此對其進行了不同藥物的造模。HepG2是一種肝細胞癌細胞系，通常被用作體外肝臟毒性模型，在這里被用作對照[5]。對乙酰氨基酚（APAP）是一種用于緩解慢性疼痛或退燒的鎮痛藥，過量服用可直接導致肝細胞損傷并產生DILI。
為了評估APAP對肝臟的毒性，作者用0.5、3或10 mM的APAP分別處理HLO和HepG2球狀體7天。用APAP處理HLOs會導致白蛋白分泌和細胞ATP水平顯著下降，且呈劑量依賴性?；钚匝酰≧OS）的形成顯著增加也證明了APAP處理后GSH消耗導致的氧化應激，螢光探針CellROX的強度增加也揭示了這一點。
而在HepG2球狀體中，白蛋白水平在APAP處理后沒有明顯變化，ATP水平只有在高劑量（10 mM）APAP處理后才出現下降，但也觀察到明顯的氧化應激。這些結果強調，HLOs比HepG2球狀體對APAP誘導的毒性更敏感。
原文圖2 使用藥物處理后的HLOs進行表型分析
補充圖1 使用藥物處理后的HepG2球狀體進行表型分析
非阿尿苷（FIAU）是一種抗病毒核苷類似物，在人體中會引起特定的肝臟脂肪變性和嚴重的肝損傷[6]。在FIAU處理后，HLOs的白蛋白分泌呈劑量依賴性下降，表明藥物誘導的肝細胞損傷。Bodipy染色顯示明顯的脂質積累，表明FIAU治療誘發的肝脂肪變性。此外，線粒體膜電位敏感染料TMRM的密度降低也表明線粒體膜明顯去極化，這可能是FIAU誘導脂肪變性的原因之一。
氨甲蝶呤（MTX）是另一種已被發現會導致人類肝臟損傷的藥物，可引起脂肪變性、纖維化甚至肝硬化[7]。MTX處理7天的HLO會出現顯著的脂質積累和纖維化，由于HepG2球狀體不含肝星狀細胞，所以MTX處理后在HepG2細胞中未檢測到膠原I信號。
特異質性DILI（I-DILI）是一種罕見疾病，是臨床上難以預測的肝毒性形式之一。一般認為，I-DILI是由藥物或活性代謝物的內在化學反應性引起的。TAK-875是一種G蛋白偶聯受體40（GPR40）激動劑，30 μM TAK-875處理HLO1周后，發現ROS形成增加，同時炎性細胞因子單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細胞介素6（IL-6）的釋放也顯著增加。
治療后未發現HLOs白蛋白分泌異常。這些結果表明，TAK-875處理的HLO在氧化應激和免疫反應中具有可檢測到的毒性。HepG2球狀體經TAK-875處理后也顯示出ROS的積累，但未發現炎性細胞因子的影響，這可能是由于缺乏免疫細胞的緣故。
3、基于HLOs高內涵分析預測抗肝纖維化藥物療效
通過上述實驗設置，作者已經證明HLO能夠模擬不同藥物誘導的多種毒性表型，如脂肪肝變性、纖維化、線粒體功能障礙、氧化應激和免疫反應。接下來，作者希望利用HLO建立一個高通量平臺，進行抗肝纖維化藥物篩選。轉化生長因子β（TGFβ）和脂多糖（LPS）是眾所周知的常見致病因子，可誘發多種肝纖維化。
原文圖3 使用HLO基于高內涵分析預測抗肝纖維化藥物療效
在用50 ng/mL的TGFβ或200 ng/mL的LPS處理后，在膠原I染色中觀察到大量碎裂，這可能是由于細胞死亡所致。因此，作者采用25 ng/mL的TGFβ處理作為纖維化模型，用于后期篩選。
然后，建立高內涵分析，提取并量化三種類型的類器官中與類器官形狀、膠原分布和熒光強度相關的共16個特征，以評估抗纖維化效果，然后進行了T分布隨機鄰接嵌入（tSNE）分析，以確定化合物之間的主要聚類。這表明這些化合物可能具有抗纖維化作用，其中SD208是一種已確定的TGFβ抑制劑。對MTX誘導和LPS誘導的肝纖維化HLO模型的進一步分析也表明，SD208在MTX和LPS誘導的肝纖維化中具有潛在的抗纖維化作用，伊馬替尼在MTX誘導的肝纖維化中具有潛在的抗纖維化作用。
03、編者點評
作者證明了HLO在培養皿中模擬DILI和高通量抗纖維化化合物篩選中的效用。然而，盡管HLO對誘導纖維化或免疫應答的藥物有功能反應，表明HLOs中存在功能性星狀細胞和免疫細胞，但作者在本研究中并未對HLOs中各細胞類型的組成和功能進行仔細研究。綜上所述，人誘導多能干細胞誘導的HLO保留了肝臟組織的特征，可推進類器官的基礎研究，促進藥物研發及疾病建模相關研究的發展！
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參考文獻
[1] Hammer H, Schmidt F, Marx-Stoelting P, Potz O, Braeuning A. Cross-species analysis of hepatic cytochrome P450 and transport protein expression. Arch Toxicol. 2021;95:117–133.
[2] Mosedale M, Cai Y, Eaddy JS, Kirby PJ, Wolenski FS, Dragan Y, et al. Human-relevant mechanisms and risk factors for TAK-875-induced liver injury identified via a gene pathway-based approach in collaborative cross mice. Toxicology. 2021;461:152902.
[3] Ouchi R, Togo S, Kimura M, Shinozawa T, Koido M, Koike H, et al. Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell Metab. 2019;30(374–84).
[4] Shinozawa T, Kimura M, Cai Y, Saiki N, Yoneyama Y, Ouchi R, et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 2021;160(831–46).
[5] Ramirez T, Strigun A, Verlohner A, Huener HA, Peter E, Herold M, et al. Prediction of liver toxicity and mode of action using metabolomics in vitro in HepG2 cells. Arch Toxicol. 2018;92:893–906.
[6] Jolly CE, Douglas O, Kamalian L, Jenkins RE, Beckett AJ, Penman SL, et al. The utility of a differentiated preclinical liver model, HepaRG cells, in investigating delayed toxicity via inhibition of mitochondrial-replication induced by fialuridine. Toxicol Appl Pharmacol. 2020;403:115163.
7] Bath RK, Brar NK, Forouhar FA, Wu GY. A review of methotrexate-associated hepatotoxicity. J Dig Dis. 2014;15:517–524