自從2013年張鋒等使用CRISPR系統(tǒng)成功的在人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因編輯以來(lái)，CRISPR/Cas9技術(shù)給生命科學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了巨大沖擊。文庫(kù)病毒的運(yùn)用也為靶標(biāo)的篩選帶來(lái)了新的方向。上個(gè)月剛剛放榜不久的面上和青年基金的結(jié)果顯示，有十幾個(gè)項(xiàng)目都和cas9文庫(kù)相關(guān)。關(guān)于文庫(kù)病毒又“火”了起來(lái)，很多老師也想要用上文庫(kù)病毒篩選的技術(shù)為自己的文章增色，但是還不是很清楚它的原理以及在文章中的具體運(yùn)用。接下來(lái)就跟著小編一起來(lái)學(xué)習(xí)一下吧。
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用于高通量篩選文庫(kù)的形式主要有陣列文庫(kù)和混合文庫(kù)兩種。
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前者將單個(gè)或數(shù)個(gè)sgRNA列于芯片或多孔板中進(jìn)行處理，每孔中的基因編輯序列已知；后者則是用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)待篩選sgRNA文庫(kù)并富集陽(yáng)性克隆，隨后轉(zhuǎn)至宿主細(xì)胞以引入各種基因突變，最終通過(guò)高通量測(cè)序等方法獲得結(jié)果。相比之下，混合文庫(kù)篩選成本低、操作簡(jiǎn)單且可用于體內(nèi)研究，能夠更全面地覆蓋全基因組，侵染的細(xì)胞可在長(zhǎng)期培養(yǎng)后檢測(cè)結(jié)果。CRISPR 文庫(kù)多使用混合文庫(kù)形式進(jìn)行高通量篩選。
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文庫(kù)病毒運(yùn)用在文章中的流程簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)分為四步：
1.文庫(kù)的制備和慢病毒的包裝；
2.細(xì)胞的感染及抗性的篩選；
3.進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組（如加藥、加壓等）和對(duì)照組的處理；
4.測(cè)序分析差異基因。通過(guò)這樣的方式可以篩選得到藥敏基因、生存必需基因、耐藥基因以及腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。
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每個(gè)步驟有一些要注意的點(diǎn)：
對(duì)于文庫(kù)的構(gòu)建而言：針對(duì)某個(gè)物種，每個(gè)基因設(shè)計(jì)3個(gè)或者3個(gè)以上的sgRNA,高通量合成sgRNA,然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒載體中。包裝GeCKO慢病毒文庫(kù)，并以低MOI（一般標(biāo)準(zhǔn)<0.3）感染靶細(xì)胞，保證一個(gè)病毒顆粒感染一個(gè)細(xì)胞，篩選同時(shí)表達(dá)sgRNA和Cas9的細(xì)胞；每個(gè)細(xì)胞都只會(huì)敲除自身攜帶的sgRNA對(duì)應(yīng)的一個(gè)基因，細(xì)胞文庫(kù)中包含的細(xì)胞的數(shù)量一般為細(xì)胞文庫(kù)中全部sgRNA數(shù)量的100-1000倍。將全基因組敲除細(xì)胞庫(kù)分成兩份，其中一份作為實(shí)驗(yàn)組施加篩選壓力，如：病毒侵染、藥物治療等；另一份作為對(duì)照組。根據(jù)耐藥性、增殖能力、存活能力等表型篩選細(xì)胞。最后對(duì)于候選基因的選擇上將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分別抽提基因組，PCR擴(kuò)增sgRNA片段，高通量測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
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臨床科研課題的設(shè)計(jì)上可以套用吉?jiǎng)P的公式“A基因通過(guò)調(diào)控B機(jī)制影響C疾病的D功能”。這其中最開(kāi)始的也是最重要的一步就是找到關(guān)鍵的“A基因”。下面借張鋒教授13年發(fā)表的文獻(xiàn)[1]，來(lái)介紹一下怎么篩選得到藥物相關(guān)的基因。首先作者用文庫(kù)病毒去感染腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)375，接著用puro對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選。對(duì)這些在gRNA介導(dǎo)的基因敲除之后，對(duì)細(xì)胞給予加藥處理，加入化療藥物的抑制劑—PLX。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被敲除了某些基因之后，細(xì)胞對(duì)PLX出現(xiàn)耐藥性。通過(guò)高通量測(cè)序得到那些由gRNA敲除的基因，這些基因就是相關(guān)的耐藥基因，作者通過(guò)這種篩選方法找到了藥物相關(guān)的基因NF2。
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接下來(lái)，我們通過(guò)一篇高分文獻(xiàn)的解讀來(lái)看看在具體的文章中文庫(kù)病毒的運(yùn)用，以及整體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路吧。
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這是今年3月份在cancer cell上發(fā)表的一篇文章[2]，這篇文章主要介紹了作為轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要調(diào)節(jié)因子RBPs(RNA結(jié)合蛋白)，在癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)調(diào)節(jié)失調(diào)。研究人員利用以RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)的Cas9文庫(kù)的全面篩選，系統(tǒng)的研究了人類癌癥中RBP的依賴性。
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作者首先通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，發(fā)現(xiàn)了多種RBPs的表達(dá)橫跨多種癌癥。為了確定RBPs在AML中的改變程度，作者分析了來(lái)自TCGA、Leucegene數(shù)據(jù)庫(kù)中AML患者的484個(gè)經(jīng)典RBPs的mRNA的表達(dá)。在AML失調(diào)的RBPs里，作者鑒定了107個(gè)明顯上調(diào)的RBP基因以及140個(gè)下調(diào)基因。
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接著作者針對(duì)490個(gè)RBP基因構(gòu)建了一個(gè)定制的2,900個(gè)sgRNA（每個(gè)基因約6-8個(gè)）文庫(kù)。將單個(gè)sgRNA亞克隆到基于慢病毒的GFP標(biāo)記（LRG）sgRNA載體，高通量的鑒別了癌癥存活相關(guān)的基因。
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將CRISPR篩選與急性髓細(xì)胞性白血病患者的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合在一起，發(fā)現(xiàn) 21 個(gè) RBP 候選者中有8個(gè)在急性髓細(xì)胞白血病中被選擇性地需要和上調(diào)。進(jìn)一步評(píng)估了四個(gè)候選基因（RBM39、DHX37、SUPT6H、HNRNPH1）所有 sgRNA 在兩個(gè)獨(dú)立的AML細(xì)胞系MOLM-13和THP-1（MLL-AF9、NRASmut）中都表現(xiàn)出了強(qiáng)大的抑制作用。
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作者發(fā)現(xiàn)符合上述標(biāo)準(zhǔn)的最高得分候選者之一是RBM39，也稱為CAPER-α，它是一種以前被描述為與U2AF65和SF3B1相互作用的蛋白質(zhì)。研究結(jié)果顯示，與正常造血細(xì)胞相比，RBM39在急性髓細(xì)胞白血病患者樣本中的表達(dá)明顯更高。進(jìn)一步研究RBM39的功能，研究人員設(shè)計(jì)了靶向RBM39的RRM結(jié)構(gòu)域的sgRNA，并證實(shí)了RN2細(xì)胞中RBM39蛋白的敲除。隨后將表達(dá)sgRNA的RN2細(xì)胞靜脈注射到接受亞致死性照射的小鼠體內(nèi)。通過(guò)生物發(fā)光成像（圖 2C-D），觀察到接受 RBM39缺失的RN2細(xì)胞的小鼠的白血病進(jìn)展明顯延遲。此外，對(duì)晚期發(fā)病小鼠外周血的FACS分析發(fā)現(xiàn)，攜帶RBM39 sgRNA的循環(huán)白血病細(xì)胞比例較低。這些發(fā)現(xiàn)與絕對(duì)存活期的延長(zhǎng)有關(guān)。
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為了確定AML細(xì)胞中RBM39的相互作用蛋白，在 AML細(xì)胞系MOLM-13中進(jìn)行了免疫沉淀質(zhì)譜分析（IP-MS）。共鑒定出54種與RBM39相互作用的蛋白質(zhì)，它們的富集程度比IgG至少高10-倍。蛋白質(zhì)組網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了許多與剪接體復(fù)合物和核糖體生物發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)方法還發(fā)現(xiàn)了31個(gè)與RBM39相互作用的RBPs也出現(xiàn)在CRISPR篩選中。在對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病的基因篩選中，有 15個(gè)RBPs表現(xiàn)出很強(qiáng)的性質(zhì)（>2倍的耗竭）。
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藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新興領(lǐng)域是小分子藥物的特征描述，這些藥物可以調(diào)節(jié)E3連接酶以促進(jìn)靶向蛋白質(zhì)降解。觀察到與正常造血祖細(xì)胞相比，DCAF15 在急性髓細(xì)胞白血病患者樣本中的表達(dá)更高（圖 5A）。E7070通過(guò)募集DCAF15誘導(dǎo)RBM39降解來(lái)靶向剪接。E7070濃度的增加會(huì)導(dǎo)致人白血病細(xì)胞中 RBM39和HOXA9靶基因（BMI-1和MYB）蛋白水平的劑量依賴性降低。E7070暴露會(huì)導(dǎo)致急性髓細(xì)胞白血病在體外處理急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞48小時(shí)后，G2/M細(xì)胞周期停滯受損，細(xì)胞凋亡增加。接下來(lái)，通過(guò)將表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶的急性髓細(xì)胞移植到免疫缺陷受體小鼠體內(nèi)，評(píng)估了E7070對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病進(jìn)展的體內(nèi)療效。與體外研究結(jié)果一致，與藥物對(duì)照組相比，服用E7070對(duì)于兩種異種種植模型MOLM-13和OCI-AML3都有很強(qiáng)的抗白血病的作用。外周血和骨髓的FACS分析表明，E7070治療動(dòng)物的MOLM細(xì)胞大幅減少，細(xì)胞凋亡率升高。免疫組化分析骨髓和脾臟中RBM39的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了E7070治療動(dòng)物體內(nèi)RBM39的降解?？傮w而言，服用E7070明顯延長(zhǎng)了兩種急性髓細(xì)胞癌異種移植模型的存活時(shí)間。E7070治療三個(gè)不同患者的五個(gè)患者衍生異種移植物（PDX）表明，E7070治療每個(gè)病例都能減少白血病負(fù)擔(dān)。總之，這些研究結(jié)果表明了E7070對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病的影響優(yōu)于對(duì)正常人造血細(xì)胞的影響。
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綜上，作者使用綜合性的CRISPR/Cas9結(jié)構(gòu)域篩選靶向RNA結(jié)合域的490個(gè)經(jīng)典RBPs來(lái)研究RBP與人類癌癥的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在急性髓細(xì)胞性白血病與RBPs互作會(huì)上調(diào)、且對(duì)RNA剪接和急性髓細(xì)胞性白血病生存相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)。此網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員RBM39會(huì)影響HOXA9和急性髓細(xì)胞性白血病中其它RBPs的表達(dá)，RBM39在剪接中的丟失進(jìn)一步導(dǎo)致了急性髓細(xì)胞性白血病剪接體突變的致命性，但也提供了一個(gè)使急性髓細(xì)胞性白血病耐受RBP剪接突變的治療策略。在這篇文章中作者使用文庫(kù)病毒結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析的方式快速篩選出目的基因，如果各位老師相關(guān)實(shí)驗(yàn)涉及到基因篩選的相關(guān)內(nèi)容，可以參考上述的文章思路，也歡迎老師們和我們咨詢文庫(kù)病毒相關(guān)的信息。
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【參考文獻(xiàn)】
1.Shalem, O., et al., Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-87.
2.Wang, E., et al., Targeting an RNA-Binding Protein Network in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Cell, 2019. 35(3): p. 369-384.e7.?