自從2013年張鋒等使用CRISPR系統成功的在人類細胞和小鼠細胞中實現了基因編輯以來，CRISPR/Cas9技術給生命科學領域帶來了巨大沖擊。文庫病毒的運用也為靶標的篩選帶來了新的方向。上個月剛剛放榜不久的面上和青年基金的結果顯示，有十幾個項目都和cas9文庫相關。關于文庫病毒又“火”了起來，很多老師也想要用上文庫病毒篩選的技術為自己的文章增色，但是還不是很清楚它的原理以及在文章中的具體運用。接下來就跟著小編一起來學習一下吧。

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用于高通量篩選文庫的形式主要有陣列文庫和混合文庫兩種。

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前者將單個或數個sgRNA列于芯片或多孔板中進行處理，每孔中的基因編輯序列已知；后者則是用計算機設計待篩選sgRNA文庫并富集陽性克隆，隨后轉至宿主細胞以引入各種基因突變，最終通過高通量測序等方法獲得結果。相比之下，混合文庫篩選成本低、操作簡單且可用于體內研究，能夠更全面地覆蓋全基因組，侵染的細胞可在長期培養后檢測結果。CRISPR 文庫多使用混合文庫形式進行高通量篩選。

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文庫病毒運用在文章中的流程簡單來說分為四步：

1.文庫的制備和慢病毒的包裝；

2.細胞的感染及抗性的篩選；

3.進行實驗組（如加藥、加壓等）和對照組的處理；

4.測序分析差異基因。通過這樣的方式可以篩選得到藥敏基因、生存必需基因、耐藥基因以及腫瘤增殖和轉移相關基因。

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每個步驟有一些要注意的點：

對于文庫的構建而言：針對某個物種，每個基因設計3個或者3個以上的sgRNA,高通量合成sgRNA,然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒載體中。包裝GeCKO慢病毒文庫，并以低MOI（一般標準<0.3）感染靶細胞，保證一個病毒顆粒感染一個細胞，篩選同時表達sgRNA和Cas9的細胞；每個細胞都只會敲除自身攜帶的sgRNA對應的一個基因，細胞文庫中包含的細胞的數量一般為細胞文庫中全部sgRNA數量的100-1000倍。將全基因組敲除細胞庫分成兩份，其中一份作為實驗組施加篩選壓力，如：病毒侵染、藥物治療等；另一份作為對照組。根據耐藥性、增殖能力、存活能力等表型篩選細胞。最后對于候選基因的選擇上將實驗組和對照組的細胞分別抽提基因組，PCR擴增sgRNA片段，高通量測序，并進行生物信息學分析。

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臨床科研課題的設計上可以套用吉凱的公式“A基因通過調控B機制影響C疾病的D功能”。這其中最開始的也是最重要的一步就是找到關鍵的“A基因”。下面借張鋒教授13年發表的文獻[1]，來介紹一下怎么篩選得到藥物相關的基因。首先作者用文庫病毒去感染腫瘤細胞系A375，接著用puro對細胞進行篩選。對這些在gRNA介導的基因敲除之后，對細胞給予加藥處理，加入化療藥物的抑制劑—PLX。結果發現被敲除了某些基因之后，細胞對PLX出現耐藥性。通過高通量測序得到那些由gRNA敲除的基因，這些基因就是相關的耐藥基因，作者通過這種篩選方法找到了藥物相關的基因NF2。

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接下來，我們通過一篇高分文獻的解讀來看看在具體的文章中文庫病毒的運用，以及整體的實驗設計思路吧。

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這是今年3月份在cancer cell上發表的一篇文章[2]，這篇文章主要介紹了作為轉錄和翻譯的重要調節因子RBPs(RNA結合蛋白)，在癌癥中經常出現調節失調。研究人員利用以RNA結合結構域為靶點的Cas9文庫的全面篩選，系統的研究了人類癌癥中RBP的依賴性。

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作者首先通過對TCGA數據庫的分析，發現了多種RBPs的表達橫跨多種癌癥。為了確定RBPs在AML中的改變程度，作者分析了來自TCGA、Leucegene數據庫中AML患者的484個經典RBPs的mRNA的表達。在AML失調的RBPs里，作者鑒定了107個明顯上調的RBP基因以及140個下調基因。

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接著作者針對490個RBP基因構建了一個定制的2,900個sgRNA（每個基因約6-8個）文庫。將單個sgRNA亞克隆到基于慢病毒的GFP標記（LRG）sgRNA載體，高通量的鑒別了癌癥存活相關的基因。

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將CRISPR篩選與急性髓細胞性白血病患者的轉錄組分析結合在一起，發現 21 個 RBP 候選者中有8個在急性髓細胞白血病中被選擇性地需要和上調。進一步評估了四個候選基因（RBM39、DHX37、SUPT6H、HNRNPH1）所有 sgRNA 在兩個獨立的AML細胞系MOLM-13和THP-1（MLL-AF9、NRASmut）中都表現出了強大的抑制作用。

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作者發現符合上述標準的最高得分候選者之一是RBM39，也稱為CAPER-α，它是一種以前被描述為與U2AF65和SF3B1相互作用的蛋白質。研究結果顯示，與正常造血細胞相比，RBM39在急性髓細胞白血病患者樣本中的表達明顯更高。進一步研究RBM39的功能，研究人員設計了靶向RBM39的RRM結構域的sgRNA，并證實了RN2細胞中RBM39蛋白的敲除。隨后將表達sgRNA的RN2細胞靜脈注射到接受亞致死性照射的小鼠體內。通過生物發光成像（圖 2C-D），觀察到接受 RBM39缺失的RN2細胞的小鼠的白血病進展明顯延遲。此外，對晚期發病小鼠外周血的FACS分析發現，攜帶RBM39 sgRNA的循環白血病細胞比例較低。這些發現與絕對存活期的延長有關。

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為了確定AML細胞中RBM39的相互作用蛋白，在 AML細胞系MOLM-13中進行了免疫沉淀質譜分析（IP-MS）。共鑒定出54種與RBM39相互作用的蛋白質，它們的富集程度比IgG至少高10-倍。蛋白質組網絡分析發現了許多與剪接體復合物和核糖體生物發生相關的蛋白質。蛋白質組學方法還發現了31個與RBM39相互作用的RBPs也出現在CRISPR篩選中。在對急性髓細胞性白血病的基因篩選中，有 15個RBPs表現出很強的性質（>2倍的耗竭）。

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藥物發現的一個新興領域是小分子藥物的特征描述，這些藥物可以調節E3連接酶以促進靶向蛋白質降解。觀察到與正常造血祖細胞相比，DCAF15 在急性髓細胞白血病患者樣本中的表達更高（圖 5A）。E7070通過募集DCAF15誘導RBM39降解來靶向剪接。E7070濃度的增加會導致人白血病細胞中 RBM39和HOXA9靶基因（BMI-1和MYB）蛋白水平的劑量依賴性降低。E7070暴露會導致急性髓細胞白血病在體外處理急性髓細胞白血病細胞48小時后，G2/M細胞周期停滯受損，細胞凋亡增加。接下來，通過將表達螢火蟲熒光素酶的急性髓細胞移植到免疫缺陷受體小鼠體內，評估了E7070對急性髓細胞性白血病進展的體內療效。與體外研究結果一致，與藥物對照組相比，服用E7070對于兩種異種種植模型MOLM-13和OCI-AML3都有很強的抗白血病的作用。外周血和骨髓的FACS分析表明，E7070治療動物的MOLM細胞大幅減少，細胞凋亡率升高。免疫組化分析骨髓和脾臟中RBM39的表達進一步證實了E7070治療動物體內RBM39的降解?？傮w而言，服用E7070明顯延長了兩種急性髓細胞癌異種移植模型的存活時間。E7070治療三個不同患者的五個患者衍生異種移植物（PDX）表明，E7070治療每個病例都能減少白血病負擔。總之，這些研究結果表明了E7070對急性髓細胞性白血病的影響優于對正常人造血細胞的影響。

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綜上，作者使用綜合性的CRISPR/Cas9結構域篩選靶向RNA結合域的490個經典RBPs來研究RBP與人類癌癥的相關性，發現了一個在急性髓細胞性白血病與RBPs互作會上調、且對RNA剪接和急性髓細胞性白血病生存相關的網絡。此網絡中的關鍵成員RBM39會影響HOXA9和急性髓細胞性白血病中其它RBPs的表達，RBM39在剪接中的丟失進一步導致了急性髓細胞性白血病剪接體突變的致命性，但也提供了一個使急性髓細胞性白血病耐受RBP剪接突變的治療策略。在這篇文章中作者使用文庫病毒結合轉錄組分析的方式快速篩選出目的基因，如果各位老師相關實驗涉及到基因篩選的相關內容，可以參考上述的文章思路，也歡迎老師們和我們咨詢文庫病毒相關的信息。

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【參考文獻】

1.Shalem, O., et al., Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-87.

2.Wang, E., et al., Targeting an RNA-Binding Protein Network in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Cell, 2019. 35(3): p. 369-384.e7.?