近年來，隨著基因編輯技術的迅速發展和廣泛應用，越來越多的兒科疾病及其他遺傳代謝疾病應用斑馬魚基因編輯技術，為開發治療多種兒科疾病的療法提供支持，助力兒科遺傳疾病臨床研究！
斑馬魚作為發育生物學中的經典模式生物，它在兒科疾病研究中具有天然的優勢，越來越受到該領域研究人員的廣泛應用。其研究優勢包括：胚胎發育快，可顯著縮短研究周期；體外受精和發育，透明易觀察和活體成像；多種穩定的轉基因報告品系供研究人員在多個方向開展研究；養殖容易且產卵量大，可用于高通量篩選；遺傳操作方便，且有多種方法供選擇等。今天，我們一起來解讀斑馬魚基因編輯技術在兒科遺傳疾病研究中的應用案例——
斑馬魚在兒科疾病中的研究案例
The Cases Study In Childhood Disease
01、用于先天性畸形遺傳疾病研究
研究對象：特定基因及點突變等在先天性畸形中的功能和機制
目前已報道MAP4K4與多種信號通路有關，MAP4K4的缺失會導致胚胎發育異常，而表達水平升高與癌癥、動脈粥樣硬化和糖尿病等多種疾病有關。該研究報告了21個表現出神經發育差異和多種先天性異常的家族，其在MAP4K4中攜帶一系列罕見的突變。進一步，該研究使用多種斑馬魚模型驗證了MAP4K4不同突變導致不同發育缺陷。
此外，利用斑馬魚胚胎開展分子機制研究發現MAP4K4負向調控RAS在胚胎早期的信號通路。該研究表明斑馬魚胚胎模型不僅能快速且規模驗證特定基因及其多種突變形式在先天性畸形中的功能研究，而且可用于活體研究特定基因在早期胚胎發育過程中的作用分子機制。
圖1
如圖1所示，斑馬魚胚胎中通過顯微注射異位表達MAP4K4及其突變體導致胚胎發育畸形。A、MAP4K4及其突變體異位表達導致發育缺陷，包括顱面異常（CFAs；閉合箭頭）、腦積水（白色箭頭）和泄殖腔缺陷（閉合正方形）。根據突變體在蛋白質中的位置排列（從上到下；N到C末端）。B-F，統計的異常表型包括體型、眼睛、心臟、卵黃、體長。
來源：Patterson et al., 2023, Sci. Adv
02、用于兒科血液系統研究
研究對象：特定基因在白血病發生中的功能和作用機制
急性淋巴細胞白血病是一種常見的侵襲性兒童血液癌癥，在臨床急性淋巴細胞白血病患者中發現IL7R存在功能獲得型突變，但是該突變能否驅動白血病的發生，以及它是否與其它癌基因在白血病中有協同作用仍不清楚。利用斑馬魚模型中的轉基因和細胞移植等方法，該研究揭示單獨的IL7R功能獲得型突變可誘導T細胞急性淋巴細胞白血病，進一步機制研究發現IL7R與MYC對于T細胞急性淋巴細胞白血病的發生有協同作用，且IL7R通路的激活增加了MYC誘導的T細胞急性淋巴細胞的擴散。
該研究表明斑馬魚模型不僅能快速驗證急性淋巴細胞白血病相關的致病基因，而且可用于活體研究白血病致病基因發揮功能的分子機制。
圖2
如圖2所示，T細胞中過表達IL7R功能獲得型突變可誘導T淋巴細胞增生（紅色熒光標記T淋巴細胞），以及表現出T細胞急性淋巴細胞白血病特征（細胞涂片、蘇木精-伊紅和凋亡染色）。
來源：Oliveira et al., 2022, Leukemia
圖3
如圖3所示，T細胞中同時過表達MYC和IL7R功能獲得型突變顯著加速了T細胞急性淋巴細胞白血病的發生（紅色熒光標記、細胞涂片、蘇木精-伊紅和凋亡染色）。
來源：Oliveira et al., 2022, Leukemia
03、用于兒科免疫系統研究
研究對象：特定基因在結核分枝桿菌易感性中的功能和機制
結核分枝桿菌感染在宿主中產生的反應并不相同，如抵抗感染、進展為感染性疾病，這其中的原因卻并不明確。通過易感的病人和動物模型的遺傳研究暗示宿主的遺傳差異性在結核分枝桿菌易感性中發揮關鍵作用。斑馬魚幼魚階段不僅胚胎透明，且僅先天免疫系統發揮功能，這非常有利于研究先天性免疫系統在結核分枝桿菌易感性中的作用。
該研究基于斑馬魚幼魚感染模型的研究優勢，同時借助于斑馬魚規?；蜻z傳篩選方法，獲得了對結核分枝桿菌具有不同先天易感性模式的多個突變類別。其中，一個高敏感突變體定位于lta4h基因座，該基因產物催化合成一種強效化學引誘劑和促炎類二十烷LTB4。然而，機制研究發現lta4h基因突變導致的超易感性不依賴于LTB4減少，而是通過將類花生酸底物重定向至抗炎癥脂毒素，由此產生的抗炎癥狀態通過限制腫瘤壞死因子的產生來增加分枝桿菌的增殖。進一步在臨床病人分析也發現對結核病和多菌麻風病的保護作用與LTA4H多態性相關。
該研究表明斑馬魚模型不僅便于特定基因在感染中的功能和作用分子機制研究，而且可通過規?；倪z傳篩選在活體中發現新的感染相關基因。
圖4
如上圖4所示，下調lta4h增加斑馬魚幼魚對結核分枝桿菌的易感性。A，B、瞬時敲降lta4h增加結核分枝桿菌感染的數量（熒光顯示和統計分析）。C、易感性斑馬魚幼魚感染結核分枝桿菌后存活率顯著降低。D，E、瞬時敲降lta4h增加結核分枝桿菌在特定位點的聚集（熒光顯示和統計分析）。F-H，通過藥物bestatin抑制lta4h同樣導致斑馬魚幼魚對結核分枝桿菌的易感性（數量、熒光、聚集）。
來源：Tobin et al., 2010, Cell
04、用于兒科神經系統發育研究
研究對象：特定基因在兒童神經系統發育中的功能和機制
到目前為止，科學家已發現多種單基因遺傳疾病，但是，一半以上的可能遺傳因素導致的嚴重發育障礙兒童仍然未能得到遺傳診斷，尤其是罕見的離散的遺傳疾病疾病。
該研究應用無偏見的基因型驅動分析方法來區分患有類似疾病的患者子集，從1133名患有嚴重、未確診發育障礙的兒童及其父母，結合外顯子組測序和基于陣列的染色體重排檢測，我們發現了12個與發育障礙相關的新基因。在此基礎上，借助于斑馬魚瞬時敲降技術快速驗證了7個基因與神經系統發育相關。該研究表明斑馬魚模型可用于快速驗證臨床上發現的特定基因和突變在兒童神經系統發育中的功能，進一步還可利用斑馬魚研究技術活體揭示相關基因的作用分子機制。
圖5
如上圖5所示，斑馬魚中瞬時敲降小頭畸形患者中存在變異的七個基因同樣導致斑馬魚神經系統發育缺陷。對照和基因敲降胚胎的明場圖像顯示頭部大小顯 著減?。簧窠浽贵w染色（抗HuC/D，綠色熒光）標記顯示對照和基因敲降組斑馬魚大腦變小。
來源：Fitzgerald et al., 2014, Nature
05、用于左右不對稱系統發育研究
研究對象：特定基因在先天性心臟缺陷的異位綜合征中的功能和機制
異位綜合征是由左右體畸形引起的先天性疾病，大約90%的異位癥患者患有嚴重的先天性心臟病，然而大多數病例的潛在的病因和機制仍然未知。該研究從63個散發性異位綜合征患者，通過分析罕見拷貝數變異（CNVs）發現了6個新的候選基因。通過斑馬魚幼魚整體原位雜交顯示這六個基因在胚胎發育早期表達，基因瞬時敲降和過表達的實驗揭示這6個基因與斑馬魚心臟環化相關。進一步通過斑馬魚模型開展深入的分子機制研究發現，這些基因可能通過調節下游pitx2和lefty2在側板中胚層中的表達來影響心臟環化。
該研究表明斑馬魚模型可用于快速驗證臨床上發現的特定基因在異位綜合癥和心臟缺陷疾病中的功能，進一步還可利用斑馬魚研究技術揭示相關基因的作用分子機制。
圖6
如上圖6所示，斑馬魚中瞬時敲降或異位過表達異位綜合征候選基因導致心臟環化異常。A、心臟環化正常和異常表型。B嗎啡啉介導的瞬時敲降導致心臟環化異常。C、CRISPR/Cas9介導的瞬時敲降導致心臟環化異常。D、mRNA異位過表達導致心臟環化異常。E、過表達可部分挽救基因敲降導致的心臟環化異常。
來源：Liu et al., 2018, Genome Medicine
06、用于非綜合征型唇腭裂疾病研究
研究對象：特定基因在非綜合征型唇腭裂發生中的功能和機制
非綜合征型唇顎裂是一種常見的嚴重顱面畸形，目前大約有25%的該疾病通過連鎖、候選基因和全基因組關聯研究確定跟遺傳變異相關。該研究采用全基因組測序和全基因組基因分型，然后進行多基因風險評分（PRS）和連鎖分析，確定一個三代大家族中非綜合征型唇腭裂的遺傳病因——PDGFRA中一種罕見的錯義變體（c.C2740T；p.R914W）。進一步利用轉基因斑馬魚品系結合瞬時敲降技術以及抑制劑藥物揭示下調PDGFRA導致非綜合征性型唇腭裂疾病的發生。
該研究表明斑馬魚模型可用于快速驗證臨床上發現的特定基因在唇腭裂疾病中的功能，進一步還可利用斑馬魚研究技術檢測和研究相關基因可能的作用分子機制。
圖7
如圖7所示，斑馬魚幼魚中下調PDGFRA導致非綜合征型唇腭裂疾病的發生，包括CRISPR/Cas9介導的基因敲降和藥物抑制PDGFRA信號通路。
來源：Yu et al., 2022, Human Molecular Genetics
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