提取+建庫！FFPE樣本文庫制備一站式解決方案！-國內聚焦-資訊-生物在線

提取+建庫！FFPE樣本文庫制備一站式解決方案！

作者：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2021-11-24T08:51 (訪問量:12150)

提取+建庫！FFPE樣本文庫制備一站式解決方案！

腫瘤樣本是檢測基因突變的載體，世界腫瘤發病率居高不下，而醫院的低溫儲存設備捉襟見肘，福爾馬林浸泡，石蠟包埋的樣本（FFPE）能在常溫長時間儲存，更受廣大臨床醫生歡迎。據統計，世界各地醫院積攢了約4億FFPE樣本，但是福爾馬林的固定、石蠟高溫浸入、較長保存時間都會導致DNA的交聯和不同程度降解，如何從這些海量樣本中提取高質量DNA，然后建庫測序并分析成為了棘手問題。翌圣生物深耕生命科學領域多年，基于自身深厚的工具酶技術和經驗積累，為FFPE DNA的NGS檢測提供完整解決方案。


圖1.FFPE DNA實驗、分析.jpg

圖1. FFPE DNA實驗、分析

FFPE DNA提取


FFPE DNA提取需經歷脫蠟、酶消化、DNA提取共3個步驟。經過潛心優化和精心打磨，翌圣重磅推出FFPE DNA提取試劑盒——MolPure? Magnetic FFPE DNA Kit（鄂漢械備20210919號）。在FFPE脫蠟步驟中，目前市場上常用的脫蠟方式是二甲苯，其強烈刺激性氣味，強烈刺激人體食道和胃，并引起嘔吐，本試劑盒采用無毒脫蠟液取代二甲苯脫蠟功效，為實驗人員健康保駕護航；在酶消化步驟中，翌圣采用精心優化提取體系，確保蛋白酶K能充分消化蛋白和相應核酸酶，保證DNA最大程度釋放和不被核酸酶消化，這一點直接體現在最終DNA產量上面。結果顯示，翌圣提取總量最高。


圖2 各試劑盒提取FFPE DNA結果.jpg

圖2. 各試劑盒提取FFPE DNA結果

在DNA提取步驟中，傳統的手段有酚氯仿抽提、柱膜法、磁珠法，基于未來大樣本量自動化應用場景考量，翌圣采用獨家磁珠混合液，操作簡便，保證提取DNA純度，且完美兼容自動化核酸提取儀，大幅提升大樣本量FFPE DNA提取效率。

FFPE DNA文庫構建



1 酶切法建庫

FFPE DNA一般需要打斷才能建庫，和機械法打斷相比，酶切法更溫和更高效，對片段損傷更小，且不需要專門打斷儀器和耗材，降低了實驗成本。針對不同測序平臺，翌圣均布局了酶切建庫解決方案，助力客戶簡單高效進行建庫實驗。針對Illumina平臺，翌圣推出Hieff NGS? OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina?，采用最新優化的連接酶、最新型高保真酶，改善接頭連接時的片段自連并進一步提升擴增的均一性和保真性，持續提升測序結果質量。針對日益普及的MGI平臺，翌圣推出Hieff NGS? OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI?（酶切法），滿足客戶對不同測序平臺建庫需求。

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圖3. 文庫產出（50ng FFPE DNA）

圖4 文庫測序下機結果.jpg

圖4.文庫測序下機結果

2 建庫接頭

建庫完成后的混樣測序中，index（或稱barcode）是區分各個樣本的“身份證”，通常只有幾個堿基差異，而實驗操作引入的index污染、PCR擴增誤差、測序擴增誤差均造成標簽跳躍 (index hopping)，單端index長接頭、雙端組合接頭CDI(Combinational Dual Index)在區分測序樣本來源能力較為薄弱。針對這個測序中頻發的難題，在illumina和MGI測序平臺，翌圣均布局雙端特異性接頭UDI（Unique Dual Index）產品，例如，Hieff NGS? Stubby UDI Primer Kit for Illumina?雙端特異性接頭多達384種，完全滿足檢測需求。結合文庫QC，保證低污染的文庫進行混樣和測序，將大幅降低index hopping帶來的實驗困擾，助您實驗無憂。

圖5. UDI識別index hopping的原理.jpg

圖5. UDI識別index hopping的原理

3 DNA磁珠

磁珠純化是建庫關鍵環節之一，Hieff NGS? DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理，通過精心優化過的緩沖體系，可用于DNA文庫片段分選、純化，和目前廣泛使用的AMPure XP Beads使用方式相同，片段回收效率和文庫大小分布均高度吻合，因此可無縫替代AMPure XP Beads，有效降低建庫成本。

表1.不同品牌磁珠在不同比例下回收效率比較

磁珠比例

Input DNA (ng)

Yeasen

Be*

Va*

Vd*

Tr*

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

1.8×

535

534.4

99.89%

524.8

98.09%

518.4

96.90%

566.4

105.87%*

534.4

99.89%

1.2×

518.4

96.90%

537.6

100.49%*

521.6

97.50%

528

98.69%

505.6

94.50%

0.8×

499.2

93.31%

406.4

75.96%

416

77.76%

464

86.73%

425.6

79.55%

0.6×

326.4

61.01%
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