Label-free定量蛋白質組學技術是最為傳統的一種蛋白質組學定量技術，一般是以峰強度/信號或者譜圖數進行定量比較，并且對實驗的重復性具有非常高的要求。在蛋白質組學實驗中，先通過差異定量的蛋白質組學技術進行大規模的差異蛋白的篩查，再利用目標蛋白質組學技術對感興趣的蛋白進行絕對定量驗證，已經成為一種越來越常見的趨勢，特別是對很難找到抗體的目標蛋白質進行絕對定量時，目標蛋白質組學技術往往是一種更好的選擇。
Proc Natl Acad Sci U S A：采用大規模蛋白質組學定量技術（Label free）以及目標蛋白質絕對定量技術（PRM）揭示球藻應對缺鐵環境的具體機制
摘要簡介：
海洋聚球藻是分布最廣泛的浮游植物，而鐵元素是眾多海域里限制其生長的重要因素。為了研究沿海以及遠洋聚球藻菌株適應不同豐度鐵元素的機制，該課題組比較了來源于具有不同豐度鐵元素海域的聚球藻菌株的生長、生理以及蛋白質組。
馬尾藻海南部海域有大量來自撒哈拉沙漠的塵暴沉積，使得該海域鐵元素含量較高，且常年處于一個比較穩定的狀態，來自于該海域的WH8102菌株在鐵元素豐度下降后生長和生理都受到了顯著的損害，沒有表現出明顯的響應反應。WH8020是一種沿海的聚球藻菌株，來自于不斷變化的四季分明的新英格蘭大陸架，在面對不同鐵元素豐度的環境時則呈現多層次的響應反應。這些響應反應包括鐵元素獲取以及貯存、光合作用等相關蛋白質的改變、黃素氧還蛋白替代鐵氧還蛋白以及一些生理現象的變化。這些多層次的響應機制保證了菌株在不同鐵豐度的環境中具有相對穩定的生長速率。
同時該研究還發現兩個鐵元素吸收調節因子的改變與WH8020多重的蛋白質組響應反應相關，這也暗示沿海菌株與遠洋菌株相比在低鐵元素的環境中具有不同的調節閾值。
另外，研究還發現遠洋海域中鐵元素豐度長時間之內保持穩定，其低氮以及低磷環境有可能會促使菌株中鐵元素響應基因丟失，而這些基因在鐵元素豐度變化較大且氮元素和磷元素都很豐富的沿海海域里的菌株中則存在。
技術路線：
該課題組取馬尾藻海南部海域的WH8102以及WH8020，在低鐵培養基中培養一段時間后轉入無鐵培養基，最后加入不同濃度的鐵元素進行恢復，然后取這些藻體進行大規模的蛋白質組相對定量分析（labelfree）和目標蛋白質的絕對定量分析(PRM)。在藻體培養過程中同時進行生長狀態和生理指標的記錄。
研究結果：
實驗結果顯示馬尾藻海南部海域的WH8102相較于來自新英格蘭大陸架的WH8020而言在不同豐度的鐵元素環境中生長速率和Fv/FM（一個光生理指標）都不如后者穩定。這意味著來自新英格蘭大陸架的WH8020對鐵元素豐度具有更好的適應性。
Label-free結果顯示沿海菌株WH8020在不同鐵元素豐度環境中具有非常大的蛋白質組差異，包括一些鐵元素感知、鐵元素攝取以及儲存的蛋白質豐度都發生了顯著的變化。而進一步的分析顯示在WH8020適應不同濃度鐵元素豐度的環境中兩個鐵元素吸收調節因子(Fur)的異構體具有十分顯著的調節功能，他們分別調節該菌株在低濃度以及高濃度鐵元素環境中的相應反應。而遠洋菌株WH8102在不同鐵元素豐度環境中則未發現明顯的適應鐵元素豐度變化的機制。
Fig.2. Physiological and photosynthetic responses of oceanic WH8102 (Left, A–E) and coastal WH8020(Right, F–J) to [Fe′].Verticaldashed lines in Aand Fand bars in Band Gindicate the concentrationof Fe′ (plotted aslog[Fe′]) at which a given physiological parameter showed a thresholdresponse (Materials and Methods). Growth rate (circles) and photosynthetic efficiency (Fv/FMmeasured at the time the protein samples were collected, shaded regions) areshown in Aand F.ETC, membrane proteins in the photosynthetic electron transport chain. Growthcurves are shown in C and H and photosynthetic efficiency (Fv/FM) valuescollected each day are shown in D and I. Legend for C, D, H, and I is shownbelow I. (E and J) Heatmap of photosynthetic electron transport chain proteinsfor Synechococcus sp. strains WH8102 (E) and WH8020 (J). Normalized spectralcounts are given in SI Appendix, Table S4. Color indicates higher (yellow) orlower (purple) abundance relative to the centered mean value (black).
以上結果與原先學界推測并不一致，可能原因主要有兩個，一是有些遠洋海域比如馬尾藻海南部海域因為大量來自撒哈拉沙漠的塵暴積累，導致海域里的鐵元素含量很豐富并且常年相對穩定；二是鐵元素豐度適應機制不僅與鐵元素本身豐度有關，還與其他元素的豐富程度具有十分顯著的關系。
該課題組對兩個菌株的基因組大小及磷含量進行了比較，同時采用蛋白質絕對定量方法(PRM)對WH8020不同鐵元素豐度環境適應過程中具有重要影響的蛋白質進行了絕對定量，同時分析了這些蛋白質合成所需的N元素總量，發現海域里P、N元素的豐富程度與這些基因在染色體中是否存在以及相關蛋白質能否表達有關。由此，該課題組認為鐵元素適應過程及適應機制不僅與鐵元素本身有關，還和周圍環境中P、N元素的豐富程度相關。
該研究打破了原先學界猜測，發現沿海聚球藻菌株對于不同豐度鐵元素環境的適應能力相較于某些遠洋海域的聚球藻更強，并且通過大規模蛋白質組學相對定量技術（labelfree）發現了沿海菌株應對鐵元素的相應機制，同時通過染色體分析以及蛋白質絕對定量分析技術（PRM）發現了鐵元素響應機制與周邊環境P,N元素豐富程度之間的聯系，為進一步揭示聚球藻的生長機制以及類似的研究提供了非常豐度的數據積累和參考價值。