Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是最為傳統(tǒng)的一種蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，一般是以峰強度/信號或者譜圖數(shù)進行定量比較，并且對實驗的重復(fù)性具有非常高的要求。在蛋白質(zhì)組學(xué)實驗中，先通過差異定量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進行大規(guī)模的差異蛋白的篩查，再利用目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對感興趣的蛋白進行絕對定量驗證，已經(jīng)成為一種越來越常見的趨勢，特別是對很難找到抗體的目標(biāo)蛋白質(zhì)進行絕對定量時，目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)往往是一種更好的選擇。
Proc Natl Acad Sci U S A：采用大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)（Label free）以及目標(biāo)蛋白質(zhì)絕對定量技術(shù)（PRM）揭示球藻應(yīng)對缺鐵環(huán)境的具體機制
摘要簡介：
海洋聚球藻是分布最廣泛的浮游植物，而鐵元素是眾多海域里限制其生長的重要因素。為了研究沿海以及遠(yuǎn)洋聚球藻菌株適應(yīng)不同豐度鐵元素的機制，該課題組比較了來源于具有不同豐度鐵元素海域的聚球藻菌株的生長、生理以及蛋白質(zhì)組。
馬尾藻海南部海域有大量來自撒哈拉沙漠的塵暴沉積，使得該海域鐵元素含量較高，且常年處于一個比較穩(wěn)定的狀態(tài)，來自于該海域的WH8102菌株在鐵元素豐度下降后生長和生理都受到了顯著的損害，沒有表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)反應(yīng)。WH8020是一種沿海的聚球藻菌株，來自于不斷變化的四季分明的新英格蘭大陸架，在面對不同鐵元素豐度的環(huán)境時則呈現(xiàn)多層次的響應(yīng)反應(yīng)。這些響應(yīng)反應(yīng)包括鐵元素獲取以及貯存、光合作用等相關(guān)蛋白質(zhì)的改變、黃素氧還蛋白替代鐵氧還蛋白以及一些生理現(xiàn)象的變化。這些多層次的響應(yīng)機制保證了菌株在不同鐵豐度的環(huán)境中具有相對穩(wěn)定的生長速率。
同時該研究還發(fā)現(xiàn)兩個鐵元素吸收調(diào)節(jié)因子的改變與WH8020多重的蛋白質(zhì)組響應(yīng)反應(yīng)相關(guān)，這也暗示沿海菌株與遠(yuǎn)洋菌株相比在低鐵元素的環(huán)境中具有不同的調(diào)節(jié)閾值。
另外，研究還發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)洋海域中鐵元素豐度長時間之內(nèi)保持穩(wěn)定，其低氮以及低磷環(huán)境有可能會促使菌株中鐵元素響應(yīng)基因丟失，而這些基因在鐵元素豐度變化較大且氮元素和磷元素都很豐富的沿海海域里的菌株中則存在。
技術(shù)路線：
該課題組取馬尾藻海南部海域的WH8102以及WH8020，在低鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后轉(zhuǎn)入無鐵培養(yǎng)基，最后加入不同濃度的鐵元素進行恢復(fù)，然后取這些藻體進行大規(guī)模的蛋白質(zhì)組相對定量分析（labelfree）和目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對定量分析(PRM)。在藻體培養(yǎng)過程中同時進行生長狀態(tài)和生理指標(biāo)的記錄。
研究結(jié)果：
實驗結(jié)果顯示馬尾藻海南部海域的WH8102相較于來自新英格蘭大陸架的WH8020而言在不同豐度的鐵元素環(huán)境中生長速率和Fv/FM（一個光生理指標(biāo)）都不如后者穩(wěn)定。這意味著來自新英格蘭大陸架的WH8020對鐵元素豐度具有更好的適應(yīng)性。
Label-free結(jié)果顯示沿海菌株WH8020在不同鐵元素豐度環(huán)境中具有非常大的蛋白質(zhì)組差異，包括一些鐵元素感知、鐵元素攝取以及儲存的蛋白質(zhì)豐度都發(fā)生了顯著的變化。而進一步的分析顯示在WH8020適應(yīng)不同濃度鐵元素豐度的環(huán)境中兩個鐵元素吸收調(diào)節(jié)因子(Fur)的異構(gòu)體具有十分顯著的調(diào)節(jié)功能，他們分別調(diào)節(jié)該菌株在低濃度以及高濃度鐵元素環(huán)境中的相應(yīng)反應(yīng)。而遠(yuǎn)洋菌株WH8102在不同鐵元素豐度環(huán)境中則未發(fā)現(xiàn)明顯的適應(yīng)鐵元素豐度變化的機制。
Fig.2. Physiological and photosynthetic responses of oceanic WH8102 (Left, A–E) and coastal WH8020(Right, F–J) to [Fe′].Verticaldashed lines in Aand Fand bars in Band Gindicate the concentrationof Fe′ (plotted aslog[Fe′]) at which a given physiological parameter showed a thresholdresponse (Materials and Methods). Growth rate (circles) and photosynthetic efficiency (Fv/FMmeasured at the time the protein samples were collected, shaded regions) areshown in Aand F.ETC, membrane proteins in the photosynthetic electron transport chain. Growthcurves are shown in C and H and photosynthetic efficiency (Fv/FM) valuescollected each day are shown in D and I. Legend for C, D, H, and I is shownbelow I. (E and J) Heatmap of photosynthetic electron transport chain proteinsfor Synechococcus sp. strains WH8102 (E) and WH8020 (J). Normalized spectralcounts are given in SI Appendix, Table S4. Color indicates higher (yellow) orlower (purple) abundance relative to the centered mean value (black).
以上結(jié)果與原先學(xué)界推測并不一致，可能原因主要有兩個，一是有些遠(yuǎn)洋海域比如馬尾藻海南部海域因為大量來自撒哈拉沙漠的塵暴積累，導(dǎo)致海域里的鐵元素含量很豐富并且常年相對穩(wěn)定；二是鐵元素豐度適應(yīng)機制不僅與鐵元素本身豐度有關(guān)，還與其他元素的豐富程度具有十分顯著的關(guān)系。
該課題組對兩個菌株的基因組大小及磷含量進行了比較，同時采用蛋白質(zhì)絕對定量方法(PRM)對WH8020不同鐵元素豐度環(huán)境適應(yīng)過程中具有重要影響的蛋白質(zhì)進行了絕對定量，同時分析了這些蛋白質(zhì)合成所需的N元素總量，發(fā)現(xiàn)海域里P、N元素的豐富程度與這些基因在染色體中是否存在以及相關(guān)蛋白質(zhì)能否表達(dá)有關(guān)。由此，該課題組認(rèn)為鐵元素適應(yīng)過程及適應(yīng)機制不僅與鐵元素本身有關(guān)，還和周圍環(huán)境中P、N元素的豐富程度相關(guān)。
該研究打破了原先學(xué)界猜測，發(fā)現(xiàn)沿海聚球藻菌株對于不同豐度鐵元素環(huán)境的適應(yīng)能力相較于某些遠(yuǎn)洋海域的聚球藻更強，并且通過大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)相對定量技術(shù)（labelfree）發(fā)現(xiàn)了沿海菌株應(yīng)對鐵元素的相應(yīng)機制，同時通過染色體分析以及蛋白質(zhì)絕對定量分析技術(shù)（PRM）發(fā)現(xiàn)了鐵元素響應(yīng)機制與周邊環(huán)境P,N元素豐富程度之間的聯(lián)系，為進一步揭示聚球藻的生長機制以及類似的研究提供了非常豐度的數(shù)據(jù)積累和參考價值。