IF=9.5 |DOI: 10.1073/pnas.1821116116
Protein phosphatase 2A has an essential role in promoting thymocyte survival during selection
2019年5月31日，美國科學院院刊PNAS在在線發表了浙江大學醫學院免疫學研究所魯林榮教授課題組與南京大學高翔教授課題組合作的最新研究成果 “Protein phosphatase 2A has an essential role in promoting thymocyte survival during selection”，該研究揭示了磷酸酶PP2A在調控胸腺T細胞存活和細胞選擇中的關鍵調控作用。
其中，由中科新生命提供的定量磷酸化組學服務，為該研究的機制探索提供了數據基礎。
磷酸酶PP2A及其介導的去磷酸化在維持胸腺T細胞存活過程中的作用
研究背景：
T細胞在胸腺發育的過程中，只有少數細胞表面表達的T細胞受體（T cell receptor，TCR）能與自身MHC-多肽以中低親和力結合的CD4+ CD8+雙陽性（double positive, DP）T細胞能存活下來，并進一步發育成單陽性CD4+ 或CD8+ T細胞，釋放到外周發揮免疫保護作用。目前，一般認為TCR激活能通過誘導Bcl-2家族抗凋亡蛋白的表達來維持細胞的存活，然而，這些細胞在接受TCR信號后如何能促使細胞存活的具體機制仍然不完全明了。
研究材料：
野生型小鼠(WT mice)、條件敲除型小鼠（PP2Ac cKO mice）
研究結果：
1. 磷酸化修飾組：磷酸化修飾在T細胞成熟過程中的變化，并構建去磷酸酶PP2A條件敲除型小鼠。
為了探究T細胞在胸腺發育過程中的磷酸化調控作用，首先通過anti-CD3刺激野生型鼠的胸腺細胞，模擬DP細胞發育成熟的過程，隨后利用iTRAQ磷酸化修飾組, 分析刺激后的磷酸化修飾變化。修飾組共發現了超過4000個磷酸化修飾位點，然而差異變化顯示，該過程中并沒有模型的整體磷酸化上調變化，而是上調與下調的磷酸化位點數目相當，其中， 27個蛋白磷酸化差異超1.5倍，30個磷酸化蛋白顯示相似的去磷酸化程度變化 (圖1.A)。因此，該發現表明，該T細胞在胸腺發育過程中磷酸化與去磷酸化可能發揮了同樣重要的作用。
進一步，作者將關注點放在去磷酸化差異大的五個蛋白上，發現其中兩個蛋白TOP2與Smarca4已經被報道過，它們上游的去磷酸酶為PP2A。由此推測，PP2A很可能在DP細胞發育過程中發揮重要功能。為了證明該推測，作者構建了敲除型小鼠，為了避免胚胎致死，該小鼠為T細胞特異性的PP2A條件敲除（conditional knockout, cKO）。隨后再次通過刺激處理，并進行磷酸化修飾組學分析，探究修飾差異變化的蛋白。研究表明（圖1.B），在PP2A cKO細胞中，刺激后共有370個蛋白發生磷酸化變化，發生1.75倍的磷酸化上調的蛋白有35個，而其中有6個蛋白與細胞存活相關，比如LSP1和DAXX等蛋白的磷酸化已知與細胞對凋亡誘導的敏感性相關，該結果提示，PP2A很可能通過去磷酸化介導的凋亡通路調控來保證細胞存活。
圖1.磷酸化修飾組分析
2. 驗證：PP2A敲除型小鼠中，胸腺發育異常，同時發育成熟的外周T細胞數目減少。
利用表型實驗，作者進一步表明了PP2A確實在T細胞的胸腺發育過程中發揮重要作用。結果顯示，在胸腺發育過程中（圖2），PP2A敲除后小鼠的胸腺尺寸明顯變小，同時CD4-CD8-雙陰性細胞（double negative，DN）的百分比增加，且CD4+CD8+ DP的 T細胞顯著減少。外周 T細胞檢測表明（圖3），PP2A敲除小鼠的脾臟、淋巴結中的CD4+ T細胞、CD8+ T細胞數目減少。
圖2.PP2Ac缺失致T細胞發育缺陷
圖3. PP2Ac缺失致外周T細胞數目降低
3. 機制探究：PP2A敲除型小鼠中，胸腺細胞的存活受損。
為了確定胸腺細胞發育受損可能是由TCR信號通路受損引起的，作者分析了TCR下游的信號通路變化，然而未發現信號通路中關鍵因子（PLC-γ1, AKT, Erk1/2, and Jnk）的磷酸化變化。此外，增殖實驗也表明，PP2A缺失沒有影響胸腺細胞的增殖能力。因此，該研究表明PP2A既不是通過改變TCR信號通路、也不是通過影響胸腺細胞增殖而引起胸腺發育受損的。
接下來，利用細胞存活實驗（圖4），作者發現PP2A敲除后, DP細胞存活能力受到影響，凋亡明顯增加。研究表明， PP2Ac缺失導致DP胸腺細胞凋亡顯著增加，同時caspase-3活性增強。在TNF-α或Fas-L刺激后，在PP2Ac cKO細胞中也觀察到DP胸腺細胞的凋亡增加。
圖4. PP2Ac缺失致胸腺細胞存活受損
4. 機制驗證：Bcl2轉基因表達或p53敲除回復了PP2A cKO小鼠中胸腺細胞的發育缺陷。
最后， 為了確定損傷的胸腺細胞發育是否能夠通過增強細胞存活得以回復（圖5），作者利用表達抗凋亡基因的Bcl2轉基因小鼠與PP2A cKO小鼠雜交，以及利用促凋亡基因p53敲除小鼠與PP2A cKO小鼠雜交，結果均發現，PP2Ac缺陷小鼠中，胸腺細胞水平下降很大程度上得以回復。因此，該結果表明PP2A是通過促進細胞存活，保證胸腺細胞發育為成熟T細胞。
圖5. Bcl2轉基因鼠能回復細胞凋亡缺陷.
小編總結：
本研究揭示了PP2A介導的蛋白去磷酸化在維持胸腺細胞存活、T細胞選擇中的關鍵調控作用，而磷酸化修飾組分析，為后續的機制探究提供了極為重要的指導作用。磷酸化組分析發現，差異磷酸化蛋白（LSP1和DAXX等）的磷酸化已知與細胞對凋亡誘導的敏感性相關，這將PP2A缺失引起的胸腺發育受損原因指向了與細胞凋亡相關的過程中，使得后續的探究實驗建立在這個方向上。因此，修飾組學可以說是幫助我們去挖掘機制的重要手段之一。
最后，中科新生命祝賀浙江大學魯林榮教授文章被高水平雜志接收，同時也由衷欣喜我們提供的磷酸化組服務，為老師取得豐碩成果助一份力。
中科新生命一直秉承?！靶隆敝隆百|”的宗旨，以往在磷酸化組研究方向上，已有多篇合作文獻，如下（部分）：
客戶文獻1： Cell Research: The novel quantitative trait locus GL3.1 controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1;3
客戶文獻2：Molecular & Cellular Proteomics: Quantitative Phosphoproteomic and Metabonomic Analyses Reveal GmMYB173 Optimizes Flavonoid Metabolism in Soybean under Salt Stress.
客戶文獻3：Molecular & Cellular Proteomics：Mechanisms of soybean roots' tolerances to salinity revealed by proteomic and phosphoproteomic comparisons between two cultivars.
關于中科新生命的修飾組學服務：
1. 基于國內頂尖的蛋白質組服務平臺，業內率先推出修飾組學分析服務
2. 采用金標材料富集修飾肽段
3. 合作文章發表：國內率先+數量**的磷酸化、泛素化組代表文章