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碘化丙啶（Propidium iodide）是一個(gè)小分子芳香化合物，通常在研究和開(kāi)發(fā)中作為熒光核酸結(jié)合染料。PI通常用于區(qū)分活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞,因?yàn)樗梢宰杂蓾B透死亡或損傷細(xì)胞膜,而不能進(jìn)入正常活細(xì)胞。碘化丙啶能染色核酸，如DNA和RNA，因此可用作流式細(xì)胞儀、原位雜交和免疫組織化學(xué)應(yīng)用中細(xì)胞膜完整性的指示劑。

在樣品中加入碘化丙啶后，細(xì)胞膜永久性或可逆性損傷的細(xì)胞將發(fā)出紅色熒光。通過(guò)這種方式，碘化丙啶能夠快速且可靠地識(shí)別和定量死亡和壞死細(xì)胞。碘化丙啶有助于確定整體細(xì)胞活性，這是用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞群體對(duì)細(xì)胞毒性藥物或其他環(huán)境因素的反應(yīng)的重要參數(shù)。

活力研究通常包括使用碘化丙啶染色，搭配細(xì)胞凋亡標(biāo)記染料（如Annexin V-FITC或發(fā)出明亮綠色熒光的iFluor® 488）。當(dāng)一起使用時(shí)，可以獲得總細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且可以觀察樣本中的細(xì)胞形態(tài)。例如，使用這兩種染色劑可以區(qū)分完整細(xì)胞（iFluor® 488-PI-）、早期凋亡細(xì)胞（iFluor® 488+PI-）和晚期凋亡或壞死細(xì)胞（iFluor® 488+PI+）。

碘化丙啶的化學(xué)結(jié)構(gòu)

PI染色方案

用PI染色細(xì)胞的基本方法如下:

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：將PI（碘化丙啶）溶解在PBS或Tris-EDTA緩沖液等緩沖溶液中。染色溶液中PI的濃度可能因?qū)嶒?yàn)條件而異，但通常為1-5mg/ml。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞從生長(zhǎng)表面（例如培養(yǎng)皿）分離，粘附細(xì)胞使用胰蛋白酶處理，懸浮細(xì)胞使用離心。將多達(dá)1X10^6個(gè)細(xì)胞/100微升分裝到聚苯乙烯管中，并在輕輕渦旋的同時(shí)加入70%的乙醇。

3. 細(xì)胞清洗：向細(xì)胞添加2毫升PBS，以300 X g離心5分鐘，然后將緩沖液從沉積的細(xì)胞中倒出。重復(fù)此步驟共2次，以除去殘留的培養(yǎng)基或血清成分。

4. 細(xì)胞重懸：含有PI的染色溶液（例如，PBS中0.1%的BSA、RNase、PI儲(chǔ)備液）應(yīng)加入到細(xì)胞懸液中，以達(dá)到所需的PI濃度。輕輕混合細(xì)胞和PI溶液以確保均勻染色。

5. 細(xì)胞孵育：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，在37攝氏度下孵育細(xì)胞一段時(shí)間。通常在暗室中用PI孵育細(xì)胞超過(guò)30分鐘，以防止光照導(dǎo)致降解。

6. 分析細(xì)胞：孵育后，用PI染色的細(xì)胞可以使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，激光發(fā)出的光波長(zhǎng)為488nm（藍(lán)綠色）來(lái)激發(fā)細(xì)胞。發(fā)出的熒光為紅色，波長(zhǎng)為617nm。在免疫組織化學(xué)（IHC）中，PI常用作核染色劑，用于在組織切片中染色細(xì)胞核。

該方案應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和優(yōu)化進(jìn)行調(diào)整。

碘化丙啶的優(yōu)點(diǎn)及常見(jiàn)問(wèn)題

使用碘化丙啶染色技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是這些方法幾乎不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損耗，并且可以避免通過(guò)水解引起的細(xì)胞損傷。然而，使用碘化丙啶也存在一些常見(jiàn)的問(wèn)題。傳統(tǒng)的Annexin V/PI方案以及類似的染色方案可能導(dǎo)致相當(dāng)數(shù)量的假陽(yáng)性事件（>40%）。這種假陽(yáng)性與碘化丙啶也會(huì)染色細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的RNA有關(guān)。這個(gè)問(wèn)題可能出現(xiàn)在初代細(xì)胞和細(xì)胞系中，最常見(jiàn)于核質(zhì)比較小的較大細(xì)胞。

由于碘化丙啶是一種不可穿透細(xì)胞膜的DNA染料，它通常與一種可穿透細(xì)胞膜的DNA染料一起用于細(xì)菌活性研究中。然而，在研究中，碘化丙啶對(duì)生物膜中貼壁細(xì)胞的染色已表現(xiàn)出明顯低于實(shí)際細(xì)菌活性的情況，這是由于細(xì)胞外核酸（eNA）的存在。觀察時(shí)，似乎會(huì)出現(xiàn)一層假死的紅色碘化丙啶染色細(xì)胞。這種情況有時(shí)會(huì)掩蓋一部分雙重染色的細(xì)胞，這些細(xì)胞內(nèi)部是綠色的，表明其活性，而紅色層則表明DNA可能位于整個(gè)細(xì)胞膜之外。

因此，這類細(xì)胞群體的活力染色結(jié)果使用另一種估計(jì)活力的方法進(jìn)行驗(yàn)證，例如，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）或熒光顯微鏡。在大多數(shù)情況下，碘化丙啶的使用限于固定或滲透的細(xì)胞，如果遇到活細(xì)胞則會(huì)被活細(xì)胞主動(dòng)排出的細(xì)胞中。在滲透和固定過(guò)程中，通常選擇使用醇類或醛類試劑。重要的是，醛和醇通常與熒光蛋白和某些表面標(biāo)記不兼容，因此對(duì)苯甲醛可能是更合適的選擇。就安全性而言，碘化丙啶是一種疑似致癌物質(zhì)，可能引起皮膚、眼睛和呼吸系統(tǒng)刺激。

研究了流體剪切力（FSS）對(duì)腎小管細(xì)胞中凋亡和壞死的影響。HK-2細(xì)胞的密集單層在靜態(tài)條件（FSS 0）或0.5 Pa流體剪切應(yīng)力（FSS 0.5）下培養(yǎng)48小時(shí)。A/細(xì)胞先用Annexin-V染色，然后立即通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析磷脂酰絲氨酸的外翻（Annexin-V熒光，X軸）和碘化丙啶（PI）的攝?。≒I熒光，Y軸）。通過(guò)Annexin-V-/PI-（左下象限）、Annexin-V+/PI-（右下象限）和Annexin-V+/PI+（右上象限）的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞（初級(jí)或次級(jí)）。B/早期凋亡和壞死細(xì)胞的比例進(jìn)行了量化，結(jié)果以細(xì)胞總?cè)后w的百分比表示。數(shù)據(jù)表示7次實(shí)驗(yàn)的平均值 ± SEM。*HK-2細(xì)胞使用Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit根據(jù)制造商的指示評(píng)估凋亡和壞死。

產(chǎn) 品

表1.Cell Meter Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒選擇指南

表2.在死細(xì)胞和固定細(xì)胞中，用核酸染色標(biāo)記細(xì)胞核

表3.Live or Dead細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒

表4.

MycoLight熒光活/死細(xì)菌成像試劑盒