植物來源的細胞外囊泡是否介導哺乳動物細胞間的信號傳導是未知的，腫瘤相關巨噬細胞在抑制腫瘤的M1型和促進腫瘤的M2型之間存在不同的極化狀態，較低的M1/M2通常與腫瘤生長有關。
2019年11月，南京中醫藥大學曹鵬研究員團隊于《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》（IF= 8.676）在線發表論文“Ginseng-derived nanoparticles alter macrophage polarization to inhibit melanoma growth”，旨在研究人參來源的細胞外囊泡是否可以調節M2型極化從而促進癌癥的免疫治療。結果發現，人參來源的細胞外囊泡 (GDNPs) 可有效促進M2至M1的極化，并產生活性氧，從而促進小鼠黑色素瘤細胞的凋亡。通過進一步研究發現GDNP誘導的M1型巨噬細胞極化主要依賴于Toll樣受體-4和髓樣分化因子MyD88介導的信號傳導通路。GDNPs作為哺乳動物免疫反應過程的免疫調節劑可能成為癌癥免疫療法的新型納米藥物。中科新生命參與了脂質組學檢測分析工作。
Ginseng-derived nanoparticles alter macrophage polarization to inhibit melanoma growth
Journal for ImmunoTherapy of Cancer
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實驗材料：
野生型C57BL/6小鼠、MyD88-、TLR4-和TLR2-缺陷型C57/BL6小鼠
鼠黑色素瘤細胞系 (B16F10)、乳腺癌細胞系（4T1）和人胚胎腎細胞系（HEK293T）
技術路線圖：
研究結果：
1. GDNPs的分布、穩定性及生物相容性
通過比較BMDM、B16F10、4T1和HEK293T細胞對GDNPs的吸收率，發現BMDMs對GDNPs的吸收效率較高并且被吸收的GDNPs主要位于細胞質中。作者首先評價不同給藥途徑下標記GDNPs在生物體內的分布情況，結果發現腹腔注射以及靜脈注射72 h后，大部分GDNPs位于肝臟和脾臟中；而灌胃后的GDNPs主要位于胃腸道中。連續跟蹤體內GDNPs，發現給藥7天后肝臟和脾臟中的GDNPs熒光信號仍然很強，這說明納米粒子的大小和結構增加了GDNPs在生物體循環過程中的穩定性和保留能力。進一步通過FACS分析發現，注射的GDNPs很容易被巨噬細胞吸收 (13.7%)，當CL存在時 (清除巨噬細胞)，可觀察到GDNPs的熒光信號在肝臟和脾臟中顯著降低。上述結果表明GDNPs在體內和體外均具有向巨噬細胞的細胞趨向性。為了評估GDNPs在體外的生物相容性，對其進行細胞活力測定，結果發現，在給藥范圍內，GDNPs在體內和體外均無顯著的毒副作用。
圖1 巨噬細胞對GDNPs的吸收效率及評價
2. 體外實驗：GDNPs改變巨噬細胞的M2型極化
M2型巨噬細胞占腫瘤相關巨噬細胞的絕大部分，因此，有效抑制或改變M2型細胞是癌癥治療的策略之一。因此，作者使用小鼠骨髓巨噬細胞加入IL-4和IL-13培養24 h使其轉變為M2型細胞，隨后加入GDNPs培養48 h，使用流式細胞儀對極化情況進行確證，結果發現GDNPs可顯著降低M2型巨噬細胞中CD206含量，而使CD80、CD86、MHC-II和TLR2/4的表達水平顯著上調。通過對M1和M2型巨噬細胞中M1-和M2-相關基因的定量分析發現，GDNPs可顯著誘導M1相關基因而使M2相關的基因下調。同時，GDNPs可導致M1相關的細胞因子和趨化因子顯著增加。上述結果表明GDNPs在體外可有效抑制巨噬細胞M2型極化。
圖2 GDNPs可抑制巨噬細胞M2型極化
3. GDNPs通過TLR4-和MyD88-途徑調控巨噬細胞極化
鑒于GDNPs所引起巨噬細胞在免疫應答過程中的反應與病原體引起的TLRs/MyD88信號通路相似，因此推測GDNPs的免疫調節作用是通過相似的信號通路實現的。在MyD88缺失型鼠中獲得M2型巨噬細胞，通過加入GDNPs培養48 h后發現M1相關的表面標志物及相關細胞因子IL-6/TNF-α并未發生上調。與上述實驗過程類似，作者發現TLR2缺失型M2型巨噬細胞可以在GDNPs存在的條件下產生上述細胞因子，但無法在TLR4缺失型M2型巨噬細胞中產生，該結果表明TLR4可能與GDNPs的配體相互作用從而導致巨噬細胞極化。作者同時也分析了從非藥用植物中提取的細胞外囊泡是否可發揮同樣的作用，結果發現從黃瓜和獼猴桃中分離得到的EVs無法將巨噬細胞極化為M1型。
4. GDNPs處理的巨噬細胞在體外抑制黑色素瘤生長
為了研究GDNPs對巨噬細胞-腫瘤細胞相互作用的影響，分別使用/不使用GDNPs處理M2型巨噬細胞后置換培養基，過48 h收集上清液培養基作為條件培養基。使用上述條件培養基分別處理B16F10黑色素瘤細胞，結果發現與未被GDNPs刺激巨噬細胞條件培養基處理的黑色素瘤細胞相比，GDNPs刺激巨噬細胞條件培養基可顯著增加黑色素瘤細胞凋亡。以往的研究報道指出總活性氧及超氧化物的含量在M1型巨噬細胞中上升，在本研究中，GDNPs處理的M2型巨噬細胞中總活性氧的含量高于未處理組，有助于M1型巨噬細胞的抗腫瘤功能。
圖3 GDNPs在體外抑制M2巨噬細胞促腫瘤細胞生長
5. GDNPs的脂質和蛋白改變巨噬細胞極化
為了探索GDNPs中調控巨噬細胞極化的關鍵組分，對GDNPs進行脂質組學的分析，結果發現GDNPs中二半乳糖單?；?/span> (DGMG，59.4%)、溶血腦磷脂 (PE，16.8%) 和神經酰胺 (Cer，13.8%)含量較高。TLR4激動劑神經酰胺是重要的腫瘤抑制因子，在本研究中作者推測GDNPs的神經酰胺可能通過TLR4激活途徑在巨噬細胞極化過程中扮演重要角色。當使用蛋白酶消化的GDNPs處理巨噬細胞時，可檢測到少量的IL-6和TNF-α，說明GDNPs中的蛋白質對于其發揮抗腫瘤效果也是至關重要的。除此之外，超聲處理的GDNPs可以導致M2型巨噬細胞M1相關的表面標志物以及IL-6和TNF-α顯著下調，這說明GDNPs對于巨噬細胞極化是必須的。
為了進一步分析巨噬細胞吸收GDNPs的途徑，作者研究發現LY294002可以顯著抑制GDNPs吸收，而巨胞飲抑制劑EIPA對其攝入無顯著影響，這說明巨胞飲并非巨噬細胞攝入GDNPs的主要途徑。
圖4 與巨噬細胞極化過程相關的GDNPs組分分析
6. 體內實驗：GDNPs體內抑制小鼠黑色素瘤生長
上述實驗結果表明GDNPs在體外具有將M2型巨噬細胞極化等多種抗腫瘤的作用，為了驗證在體內是否具有與體外同樣的作用效果，作者建立腫瘤小鼠模型 (將B16F10癌細胞皮下接種到雄性C57BL/6小鼠)，分別使用PBS或GDNPs處理，結果發現GDNPs可顯著抑制腫瘤生長。與對照組相比，GDNPs處理組小鼠體內M1型細胞數量顯著升高。通過對腹腔注射標記GDNPs跟蹤發現，注射14天后，腫瘤微環境中大部分GDNPs被巨噬細胞攝入 (23.2%)。上述結果表明GDNPs可以在體內將M2型極化為M1型，使腫瘤微環境中的T細胞增加、腫瘤細胞死亡，從而抑制腫瘤生長。為了進一步驗證GDNPs抑制腫瘤生長是否通過巨噬細胞發揮作用，作者通過比較GDNPs處理與GDNPs+氯膦酸鹽脂質體 (清除腫瘤相關巨噬細胞) 處理的腫瘤小鼠模型發現，GDNPs+氯膦酸鹽脂質體處理組小鼠無顯著的腫瘤生長抑制作用，表明GDNPs是通過腫瘤相關巨噬細胞依賴型途徑抑制腫瘤生長。
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圖5 GDNPs體內抑制黑色素瘤生長
小結：
該論文作者首次證實了GDNPs可以通過TLR4和MyD88信號途徑在體內和體外改變M2型極化，從而實現抗腫瘤作用，因此，GDNPs可以作為哺乳動物免疫反應的免疫調節劑有望成為癌癥免疫治療過程中的新型納米藥物。
原文鏈接：https://jitc.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40425-019-0817-4；IF
