本期解讀
題目：iTRAQquantitative proteomic analysis reveals lipid metabolism pathway of N+ion-implanted C. pyrenoidosa cultivated in municipal wastewater
期刊：RenewableEnergy
影響因子：6.274
合作技術(shù)：iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)
一、研究背景
利用城市污水培養(yǎng)產(chǎn)油微藻可有效降低廢水處理和生物柴油生產(chǎn)成本，成為微藻生物柴油研究的熱點(diǎn)。用于生物柴油生產(chǎn)的理想藻類物種應(yīng)表現(xiàn)出幾種有利的特性，包括高脂質(zhì)含量，高光合速率，快速生長速率和強(qiáng)抗性。開發(fā)獲得工程化高質(zhì)量藻類的方法是促進(jìn)微藻生物能源產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。離子注入技術(shù)是微生物誘變和繁殖的一種廣泛使用的方法。但是，這種方法很少用于藻類育種。在作者的初步研究中，通過N+離子注入以誘導(dǎo)小球藻突變，從而顯著提高了小球藻的脂質(zhì)生產(chǎn)率。在本研究中，作者使用iTRAQ技術(shù)定量了小球藻的原始菌株和突變菌株之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并分析了這些蛋白質(zhì)的功能。此外，對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以闡明離子植入促進(jìn)小球藻突變的分子機(jī)制。
二、技術(shù)路線
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、蛋白質(zhì)的提取和質(zhì)控
為了驗(yàn)證本研究中測試的目標(biāo)蛋白是否可靠，首先進(jìn)行了Bradford蛋白定量。隨后，進(jìn)行了12％的SDS-PAGE凝膠電泳，以確定本研究中提取的蛋白質(zhì)是否已降解。定量結(jié)果（表1）和電泳圖譜（圖1）顯示，樣品蛋白質(zhì)條帶清晰完整，表明該蛋白質(zhì)沒有降解，所獲得的蛋白質(zhì)樣品可用于后續(xù)的iTRAQ定量分析。
表1 小球藻的原始菌株（CVW）和突變菌株（CVM）樣品蛋白濃度
圖1 小球藻的原始菌株（CVW）和突變菌株（CVM）SDS-PAGE電泳圖譜
2、差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能的注釋
通過iTRAQ定量技術(shù)在小球藻細(xì)胞中總共鑒定出17種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括3種上調(diào)的蛋白質(zhì)和14種下調(diào)的蛋白質(zhì)。對在CVW和CVM之間鑒定的上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了獨(dú)立的功能注釋。17種差異表達(dá)蛋白的GO注釋結(jié)果如圖2所示。與生物過程密切相關(guān)的蛋白質(zhì)主要被鑒定為參與細(xì)胞和代謝過程的蛋白質(zhì)。通過將在CVW和CVM之間鑒定到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，我們可以預(yù)測其可能的功能并根據(jù)其功能類型對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分類，如圖3所示。大多數(shù)蛋白質(zhì)與“碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”或僅與一般功能預(yù)測有關(guān)。其他一些常見的功能蛋白包括參與“輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”，“翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生”和“細(xì)胞骨架”的蛋白。
圖2 17種差異表達(dá)蛋白的GO注釋結(jié)果
圖3 差異表達(dá)蛋白的COG功能注釋結(jié)果
3、差異蛋白功能分析
使用iTRAQ技術(shù)，在野生型和突變藻類細(xì)胞中總共鑒定出17種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。如表2所示，其中3個(gè)是3個(gè)上調(diào)的蛋白，而14個(gè)是下調(diào)的蛋白，對差異表達(dá)蛋白的功能進(jìn)行分類后，我們發(fā)現(xiàn)它們主要分布在催化酶、ATP/GTP結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和未知蛋白質(zhì)中。
表2 差異表達(dá)的蛋白質(zhì)
小球藻是一種可以進(jìn)行光合作用的真核微藻。它可以將光能、二氧化碳（CO2）和水轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，以碳水化合物分子的形式存儲在微藻細(xì)胞內(nèi)。小球藻細(xì)胞脂質(zhì)代謝途徑的示意圖如圖4所示。小球藻細(xì)胞的中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)主要由卡爾文循環(huán)，糖酵解，PPP和TCA循環(huán)組成。卡爾文循環(huán)主要提供GAP；糖酵解途徑提供乙酰輔酶A，DHAP，ATP和NADH用于TAG的合成；而PPP提供了NADPH還原所需的脂肪酸合成能力；TCA提供ATP。
圖4 小球藻脂質(zhì)調(diào)節(jié)代謝途徑的推定模型
在CVW和CVM藻類細(xì)胞之間鑒定出的大多數(shù)差異表達(dá)蛋白都屬于ATP/ GTP結(jié)合蛋白，與能量流密切相關(guān)，這些蛋白質(zhì)中的一些是催化酶。chiL基因編碼的Mg-protopoyrin IX chelatase在突變細(xì)胞中被上調(diào)了2.85倍。該蛋白是葉綠素合成分支反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，有利于葉綠素的合成，從而可以提高光合作用效率，改善微藻細(xì)胞中的碳固存效率。
基因CHLNCDRAFT_59826編碼的FBA蛋白在突變細(xì)胞中被下調(diào)了0.32倍。FBA是糖酵解途徑和卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶，下調(diào)阻礙了糖酵解過程中FBP的裂解反應(yīng)，以及卡爾文循環(huán)中以GAP為底物的代謝反應(yīng)。基因CHLNCDRAFT_48880編碼的TK蛋白下調(diào)了0.39倍。TK蛋白在PPP和卡爾文循環(huán)中起著重要作用。下調(diào)分別阻礙了PPP和卡爾文循環(huán)中兩個(gè)反應(yīng)的進(jìn)行。在卡爾文循環(huán)中，F(xiàn)BA和TK的下調(diào)將導(dǎo)致GAP在微藻中積累。GAP主要用于合成葡萄糖或進(jìn)入糖酵解過程后產(chǎn)生丙酮酸，兩者均伴隨著能量的產(chǎn)生。FBA的下調(diào)會(huì)阻礙FBP在細(xì)胞中的裂解反應(yīng)，因此，通過卡爾文循環(huán)從GAP合成的葡萄糖現(xiàn)在主要在通向PPP的途徑中形成G6P。
同時(shí)，GAP進(jìn)入糖酵解過程，GAP底物濃度的增加有助于改善糖酵解過程，從而導(dǎo)致脂肪酸合成的兩種前體乙酰輔酶A和3-磷酸甘油酸的不斷積累。在PPP上，TK的下調(diào)將嚴(yán)重阻礙GAP內(nèi)部的兩個(gè)可逆反應(yīng)。在這種情況下，來自糖酵解中間體G6P的氧化產(chǎn)物RuBP在隨后的非氧化階段將形成R5P和Xu5P。G6P底物濃度的積累有利于沿PPP的反應(yīng)。PPP的增強(qiáng)將導(dǎo)致R5P的積累，R5P主要用于在藻類細(xì)胞分裂過程中合成DNA前體核苷酸，為藻類細(xì)胞的數(shù)量增加提供了遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，強(qiáng)化的PPP將產(chǎn)生大量的NADPH，可用于合成脂肪酸。
四、小結(jié)
離子注入誘變可以通過上調(diào)Mg-protopoyrinIXchelatase來提高藻類細(xì)胞的固碳效率，從而產(chǎn)生更多的有機(jī)物和大量的小球藻，最終導(dǎo)致更大的生物量。同時(shí)FBA和TK在微藻突變株中被下調(diào)，兩者都促進(jìn)了糖酵解過程并增強(qiáng)了PPP。增強(qiáng)的糖酵解過程導(dǎo)致脂肪酸和3-磷酸甘油的積累，從而產(chǎn)生大量的ATP。PPP的增強(qiáng)會(huì)產(chǎn)生大量的NADPH還原能力，從而為脂肪酸和3-磷酸甘油酯提供充足的氫供應(yīng)。ATP的能量供應(yīng)通過多步酰化作用促進(jìn)了TAG的合成，進(jìn)而促進(jìn)了小球藻中脂質(zhì)的積累。這些發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上為離子植入誘變促進(jìn)小球藻突變株高脂質(zhì)生產(chǎn)率提供了合理化的機(jī)制。