Super enhancer，SE，即超級增強子，是一類具有超強轉錄激活特性的DNA順式調控元件，它們共同控制涉及細胞身份的關鍵基因網絡，并與眾多疾病的發生密切相關，是當前科研領域的又一藍海，之前吉凱的科研大咖已經分享過SE涉及的研究領域以及熱點方向<<研究不夠“高大上”？想沖刺高分文章？一起來看看 Super enhancer吧!>>，今天我們談談另一個話題，如何進行下游實驗設計？
在Richard A. Young于2013年提出SE概念之前，大部分學者研究基因的轉錄調控元件多局限于轉錄起始位點附近，這些調控序列一般較短且挨著啟動子，因此可以直接采用熒光素酶報告系統，構建 “增強子+啟動子”的全序列研究對應增強子的功能。但SE是一類在基因組上跨度較大（長約幾K至上百K），且遠離其調控的基因，很多老師依然想采取傳統的“增強子+啟動子”的方式驗證，顯然是不合理的，
原因在二，第一：SE跨度較大，超出構建質粒的范疇；第二：人為將SE與啟動子拉近構建（在基因組不挨著，但是構建的時候人為拼接在一起），并不能說明隔空的SE會對遠端的啟動子有調控作用。
因此，小編就盤點主要的獲得ChIP數據之后的SE功能如何驗證！！
（一）金標準：SE缺失
//適用場景：SE跨度大；不明確SE含有的轉錄因子調節網絡
要確認SE是否調控遠端基因，最理想的情況為將SE缺失，直接驗證基因的表達水平。Sox2是維持胚胎干細胞 (ESC) 的多能性的主轉錄因子之一，Bing1等人通過H3K27ac ChIP-seq 數據，發現位于 Sox2 基因座下游約 100kb，有一個跨越長度約為13kb的區域，有潛在的SE功能：
作者認為，報告基因檢測證實該序列可以作為外源性增強子發揮作用，但并未證明遠端靶基因是否可以在體內被增強子激活。敲除增強子序列是金標準方法，因此，針對該SE兩側各設計了一個CRISPR的cas9靶點，將其切割，并通過PCR以及QPCR驗證了一部分細胞實驗了SE的缺失：
由于缺失了SE，Sox2表達水平下降明顯，且正如預期的那樣，由于 Sox2 和其他幾種多能性因子的表達降低，Sox2-SE遠端缺失影響了mESC 培養物的增殖和形態
（二）SE關鍵位點抑制/激活
// 適用場景：已明確核心位點（已知感興趣的位點或者SNP）
若SE跨度短，有明確的研究位點，或者由于突變等因素引發的SE功能異常，則可以通過重塑局部表觀遺傳達到研究目的。Xu2等人將 dCas9 與賴氨酸特異性去甲基化酶 LSD1（或 KDM1A）融合，后者催化去除增強子相關的 H3-Lys4 單甲基化和二甲基化（H3K4me1/2），及 MS2-sgRNA 以招募 MCP-KRAB 抑制域，這套系統稱為enCRISPRi（是dCas9-KRAB的改進型）。將 enCRISPRi 靶向高表達β-珠蛋白基因的 K562 紅白血病細胞中的 HS2 增強子，與對照sgGal4相比，四種獨立的 sgRNA（sgHS2-1 到 sgHS2-4）實現了對 β-珠蛋白基因（HBE1、HBG1/2和HBB）的3.4至 13.7 倍抑制
作者進一步在動物水平以enCRISPRi建模，在 T 細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL) 細胞系和患者中TAL1原癌基因上游 8 kb 增強子發生突變，雜合體細胞突變通過在TAL1增強子序列處插入可變數量的核苷酸獲得，于是客戶設計了突變型特異性靶點（sgMut1 和 sgMut2），對照sgGal4，以及插入序列附近野生型靶點（sgWT1和sgWT2）。結果表明enCRISPRi有效介導了TAL1 蛋白的表達，損害了體外 T-ALL 的生長（對應f，g，h）：
同時，作者還構建了激活增強子的系統enCRISPRa，同樣取得了在動物模型通過激活增強子實現基因上調以及疾病模型的體現（對應c，d，i）。
（三）熒光素酶報告系統
//適用場景：尋找SE的關鍵調控區/位點
作為傳統研究基因調控網絡的“雙熒光素酶報告系統”，在SE的研究中，雖然無法說明遠端調控的影響，但依然有其用武之地。Michelle等人在研究EBV病毒如何調節B細胞生長時，發現EBV 編碼的 EBNA2 轉錄因子通過距離RUNX3約-97 kb 超級增強子內的特定元件激活RUNX3，該增強子區域內預測出六個EBNA2的結合位點，為了進一步尋找出主調控區域，作者構建了每個結合位點的截斷體（E表示）與RUNX3啟動子-737 到 +44一同構建至pGL3 basic，通過熒光素酶報告系統發現：
當含有所有增強子區域時，激活高達 8.4 倍，EBNA2 能夠通過E2 激活高達 3.8 倍的轉錄， E4 和 E6 被 EBNA2 激活高達 2 倍，因此說明了EBNA2主要通過E2、E4、E6三個位點調節表達，且E2 是 EBNA2 激活的關鍵位點。
隨著測序技術的發展，相信越來越多的基因組未知功能會被發現。SE作為一個科研方向，正發展壯大，為基因調控網絡又添加了一員大將，且有望成為新的藥物靶標。吉凱基因緊跟科研熱點，提供眾多工具類的產品，對超級增強子感興趣的老師們，快來咨詢吧?。?！
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