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染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。
在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DN**段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
技術(shù)流程
1、利用甲醛將細(xì)胞核中存在相互作用的蛋白-DNA形成共價(jià)鍵交聯(lián)。
Tips: 甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)形成生物復(fù)合體。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到15分鐘，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。交聯(lián)時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且復(fù)合體也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。
2、裂解細(xì)胞后利用超聲將DNA打斷為片段。
Tips：超聲波是機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。所以在超聲波斷裂時(shí)要在冰上進(jìn)行，且設(shè)置斷續(xù)的超聲程序，保證低溫。超聲探頭充分深入管中、但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。
3、加入抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)以捕獲蛋白。用protein G/A凝膠或磁珠富集所形成的免疫復(fù)合體。
4、對(duì)捕獲的DN**段進(jìn)行高通量測(cè)序及分析，獲知這些DN**段在染色體上分布的位置。
應(yīng)用領(lǐng)域
1、判斷DNA鏈的某一特定位置會(huì)出現(xiàn)何種組蛋白修飾
2、檢測(cè)RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結(jié)合位點(diǎn)的精確定位
3、 研究組蛋白共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系
4、轉(zhuǎn)錄因子研究
應(yīng)用示例
示例1：
參考文獻(xiàn)：Goren, Ozsolak, et al. Chromatin Profiling by Directly Sequencing Small Quantities of Immunoprecipitated DNA. Nat Methods. 2010, 7(1): 47–49.
主要內(nèi)容：收集培養(yǎng)的5x106 K562細(xì)胞，使用組蛋白甲基化修飾抗體H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3（ChIP-grade）進(jìn)行IP富集提取的經(jīng)過片段化的染色質(zhì)復(fù)合物，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后進(jìn)行二代測(cè)序，獲得peaks在染色質(zhì)上的分布情況。
在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DN**段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
技術(shù)流程
1、利用甲醛將細(xì)胞核中存在相互作用的蛋白-DNA形成共價(jià)鍵交聯(lián)。
Tips: 甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)形成生物復(fù)合體。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到15分鐘，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。交聯(lián)時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且復(fù)合體也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。
2、裂解細(xì)胞后利用超聲將DNA打斷為片段。
Tips：超聲波是機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。所以在超聲波斷裂時(shí)要在冰上進(jìn)行，且設(shè)置斷續(xù)的超聲程序，保證低溫。超聲探頭充分深入管中、但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。
3、加入抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)以捕獲蛋白。用protein G/A凝膠或磁珠富集所形成的免疫復(fù)合體。
4、對(duì)捕獲的DN**段進(jìn)行高通量測(cè)序及分析，獲知這些DN**段在染色體上分布的位置。
應(yīng)用領(lǐng)域
1、判斷DNA鏈的某一特定位置會(huì)出現(xiàn)何種組蛋白修飾
2、檢測(cè)RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結(jié)合位點(diǎn)的精確定位
3、 研究組蛋白共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系
4、轉(zhuǎn)錄因子研究
應(yīng)用示例
示例1：
參考文獻(xiàn)：Goren, Ozsolak, et al. Chromatin Profiling by Directly Sequencing Small Quantities of Immunoprecipitated DNA. Nat Methods. 2010, 7(1): 47–49.
主要內(nèi)容：收集培養(yǎng)的5x106 K562細(xì)胞，使用組蛋白甲基化修飾抗體H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3（ChIP-grade）進(jìn)行IP富集提取的經(jīng)過片段化的染色質(zhì)復(fù)合物，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后進(jìn)行二代測(cè)序，獲得peaks在染色質(zhì)上的分布情況。
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示例2：
參考文獻(xiàn)：Jane Gilmour, Salam A. Assi, et al. A crucial role for the ubiquitously expressed transcription factor Sp1 at early stages of hematopoietic specification. Development, 2014 , 141 (12) :2391
主要內(nèi)容：分離培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，分別收集組細(xì)胞及Flk+細(xì)胞，用轉(zhuǎn)錄因子Sp1抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)后二代測(cè)序，獲得Sp1結(jié)合位點(diǎn)在兩種細(xì)胞中的分布區(qū)域。
參考文獻(xiàn)：Jane Gilmour, Salam A. Assi, et al. A crucial role for the ubiquitously expressed transcription factor Sp1 at early stages of hematopoietic specification. Development, 2014 , 141 (12) :2391
主要內(nèi)容：分離培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，分別收集組細(xì)胞及Flk+細(xì)胞，用轉(zhuǎn)錄因子Sp1抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)后二代測(cè)序，獲得Sp1結(jié)合位點(diǎn)在兩種細(xì)胞中的分布區(qū)域。
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