請看如何運用蛋白質組學研究的經典套路“相對定量蛋白質組（篩選）+絕對定量蛋白質組學（驗證）”，在轉化醫學頂尖雜志“Theranostics”上玩出不一樣的火花！
■ 文章標題
■ 作者及課題組介紹
本文第一作者為上海交通大學薛婷博士，薛婷博士在蛋白組學領域有著豐富經驗，擅長疾病蛋白組學研究。
本文第一作者課題組為上海交通大學生物醫學工程學院生物傳熱傳質實驗室徐學敏課題組及系統生物醫學研究院系統生物醫學教育部重點實驗室嚴威課題組。
■ 研究背景
轉移性乳腺癌是威脅全球女性生命健康的頭號殺手，治愈率低。徐學敏課題組多年來致力于治療轉移性乳腺癌新方法的研究，自主研發了“冷熱交替治療系統”，該系統在轉移性乳腺癌的治療上展現出了良好的治療效果。
該系統不僅能殺滅原位腫瘤，而且能有效抑制遠端轉移，激發強而持久的抗腫瘤免疫效應，有效提升小鼠長期生存率（>60%）。
為更好地探索該系統在激發機體抗腫瘤免疫效應的機制，徐學敏課題組聯合嚴威課題組，應用高通量的蛋白組學技術，在大規模樣品上對血清糖蛋白質組展開研究。
■ 研究過程及結果
研究運用經典的差異蛋白質組學研究方法iTRAQ聯合近來興起的絕對定量蛋白質組學研究方法PRM這兩種技術，在基于Orbitrap的質譜平臺上，獲得了高質量、高可信度的數據，為解析冷熱交替治療引發的抗腫瘤免疫機制奠定了良好基礎。
圖1. 處理與未處理小鼠的血清糖蛋白多組定量蛋白質組學分析
套路第一步
相對定量蛋白質組（篩選）
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研究人員采集了冷熱交替治療后8個時間點的小鼠血清，通過富集血清中糖蛋白，利用iTRAQ標記和off-gel分離，比較治療與非治療小鼠在相同時間點下糖蛋白譜的變化。
研究人員共鑒定到308個糖蛋白，其中231個糖蛋白被定量，53個糖蛋白被定義為差異蛋白。研究人員發現冷熱交替治療引發的生物學響應具有時間特征，而急性應激響應是其率先引發的生物學事件，提示其在抗腫瘤效應中的作用。
圖2. 蛋白質組隨時間進程的定量變化
套路第二步
絕對定量蛋白質組（驗證）
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隨后，研究人進一步挑選了23個差異糖蛋白，利用高靈敏度、高選擇性的PRM 靶向蛋白組學技術，對其在8個時間點上的表達展開了靶向驗證，該驗證共涉及94份（體現了質譜高通量的優勢）小鼠血清樣品。
研究發現，冷熱交替治療激發了機體快速、強烈的急性應激響應，伴隨著一系列急性應激蛋白短時間內高水平的表達，扭轉了機體內腫瘤介導的慢性炎癥環境，打破了Th2型的腫瘤免疫抑制生態圈。急性應答微環境激發DC細胞成熟、Th1型記憶型細胞增殖，誘導機體產生Th1型抗腫瘤免疫效應，最終消退原位腫瘤，有效抑制遠端腫瘤的形成和發展?；诎邢蝌炞C的蛋白組學研究能夠進一步幫助研究者從系統性的角度了解冷熱交替治療所誘導的生物學效應。
圖3. 使用平行反應監測 (PRM) 技術對急性應激響應和白細胞活性相關蛋白繪制時間變化曲線，驗證蛋白變化
■ 研究總結
本研究利用相對定量蛋白質組學方法（iTRAQ，當然也可以有TMT、label-free等），從整體上描繪了治療后血清糖蛋白組的變化；并聯合運用絕對定量蛋白質組學技術PRM ，對目標蛋白進行了靶向驗證和研究。
PRM的驗證結果與 shotgun 有較好的可關聯性，其更強的靈敏度及選擇性，能夠提供更好的定量信息。相比傳統的依賴抗體驗證的手法 (WB，ELISA)，PRM在通量、效率、成本以及適用范圍上，有明顯的優勢。
相對定量蛋白質組學和絕對蛋白質組學技術聯合應用已成為蛋白質組學研究的金標準，在復雜臨床樣本（血清、組織、穿刺、石蠟包埋）及翻譯后修飾相關研究中具有無可匹敵的優勢，是轉化醫學和精準醫學研究的必備武器。
本文轉自Orbitrap組學俱樂部，稍作修改，如有問題，請隨時與我們聯系。
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