在miRNA 的研究中經常會涉及到miRNA 與基因靶向關系的驗證，miRNA 通過其種子序列（5’端第2-8 個堿基）靶向結合mRNA 的3’UTR 區，誘導細胞內沉默復合體介導的mRNA降解或阻遏mRNA 的翻譯過程?；谝陨显?，如圖，將目的基因3'UTR 區（或結合位點下游500bp）插入到熒光素酶報告基因載體luciferase 下游，與miRNA mimics 共轉染目的細胞，加入底物，檢測熒光素酶活性的變化。若熒光素酶活性下調，則該miRNA 與靶基因3'UTR 區存在相互作用。

常用載體：PGL3-CMV-LUC-MCS

圖1.miRNA與3‘UTR報告基因原理示意圖

雙熒光素酶報告基因檢測用于驗證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用的工作原理主要基于以下幾個步驟：

miRNA靶基因的生物信息學預測

利用生物信息學分析軟件（如TargetScan、StarBase和miRanda等）來分析特定靶基因的3'-UTR區序列是否有miRNA結合位點。

  構建報告基因載體

將預測能夠與miRNA結合的靶基因3'-UTR序列插入載體中螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）的3'-UTR。當miRNA和質粒中的插入序列結合后，miRNA會通過和所插入的序列結合從而抑制螢火蟲熒光素酶的翻譯，最終造成熒光值的降低。

miRNA/靶基因間相互作用的結構學驗證

通過雙熒光素酶報告基因實驗可以理解為通過熒光值來判斷miRNA是否與靶基因結合。如果miRNA與插入到質粒中的目標序列發生結合，miRNA將通過抑制該序列的翻譯來降低螢火蟲熒光素酶的表達，進而導致熒光強度的下降。這一變化可以作為miRNA與靶基因結合的指標。  

miRNA與靶基因的作用機制

miRNA的基本作用機制有兩種：抑制蛋白翻譯和通過不完全的miRNA-mRNA互補配對誘導靶RNA降解。miRNA通常與mRNA的3'UTR區域發生結合，通過這種方式發揮其生物學功能。  

實驗步驟

構建含靶基因3'UTR的雙熒光素酶報告基因載體，合成miRNA mimics和miRNA negative control，將載體和miRNA共轉染到細胞中，最后進行雙熒光素酶檢測以確定目的miRNA的靶基因。  

結果分析

實驗中，如果miRNA能夠與靶基因結合，熒光值會顯著性下降。如果結合位點發生突變，miRNA無法與突變后的靶基因結合，熒光值與未突變的對照組無顯著性差異，從而驗證miRNA與靶基因的結合位點。

通過上述步驟，雙熒光素酶報告基因檢測可以有效地驗證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用，為研究miRNA的功能和調控網絡提供重要工具。

翌圣雙熒光素酶報告基因檢測服務流程：

詳細操作步驟：

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材料與準備

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細胞HEK 293 細胞或指定目的細胞

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轉染試劑：可選Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉染試劑（貨號：40806ES）

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報告基因檢測試劑盒：Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：11402ES）

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其他儀器耗材酶標儀、細胞培養板等

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實驗步驟

  01 

目的細胞質粒瞬轉預實驗

當選擇在目的細胞（而非293 工具細胞）中進行驗證實驗時，首先要確認目的細胞的質粒瞬轉效率，以及摸索合適的瞬轉體系，質粒瞬轉效率>40%以上時表明預實驗通過。

02 

轉染正式實驗

a. 將狀態良好，處于對數生長期的空白細胞用0.25%胰酶消化，用完全培養基懸浮成單細胞懸液，細胞計數后，接種于24 孔培養板中；

b. 培養過夜，觀察細胞生長狀態。在細胞覆蓋率70%左右時，進行轉染實驗；

c. 轉染2 h 前換液為新鮮的培養基；

d. 轉染取無菌的1.5 mL EP 管，轉染參考轉染試劑使用說明書；

e. 轉染48 h 后收集細胞樣品。

03 報告基因檢測

A 細胞樣品收集

a. 轉染后從培養箱中取靶細胞，輕輕吸凈培養液，PBS 洗滌2 次；

b. 棄去PBS，每孔加入100 μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得）；

c. 細胞裂解后，將樣品轉移入EP 管中，-80 度冰箱保存。

B 根據報告基因檢測試劑盒說明書操作進行檢測

a. 將充分裂解后的裂解產物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的

EP 管進行后續檢測。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay

Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。

c. 熒光素酶檢測

按照儀器說明書要求將熒光檢測打開，設定參數，測定時間為10 s，測定間隔為2 s；

將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致），

另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后

測定RLU（Relative light unit），同時設置Cell Lysis buffer 為空白對照孔；

將檢測后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分

混勻后測定RLU，同時設置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對照孔。

04 數據處理與分析，計算相對熒光強度

05 提供原始數據及完整性實驗報告

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常規檢測分組

（1）mimics NC+對照質粒+海腎內參（TK)；

（2）mimics NC+ 3’UTR 野生型質粒+海腎內參（TK）；

（3）mimics NC+ 3’UTR 突變型質粒+海腎內參（TK)；

（4）mimics+對照質粒+海腎內參（TK)；

（5）mimics+3’UTR 野生型質粒（WT）+海腎內參（TK)；

（6）mimics+3’UTR 突變型質粒（MT）+海腎內參（TK)。

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實驗預期結果

翌圣可提供雙熒光素酶報告基因檢測服務，加快基礎研究及藥物篩選進度

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