在上一篇軟文中，我們重點學習了對于AAV在脊髓中的注射方式。簡單回顧一下，主要的就是三種：除了常見的尾靜脈注射之外，如果想要感染整根脊髓我們要用鞘內注射；如果我們想要實現局部的感染那么就要采用髓內注射的方式；除此之外，側腦室注射也有部分文獻會采用這種方式但是大多是觀察腦部的神經元，脊髓內的神經元的感染情況作為一個對于中樞整體的檢測的指標。今天小編將繼續帶大家學習AAV在脊髓中的靶向策略，側重于對于不同的細胞我們應該選擇什么啟動子以及搭配什么血清型。選擇什么樣的血清型和啟動子取決于我們要感染的目的細胞。所以我們首先要知道脊髓中的大概細胞類型。脊髓作為中樞神經系統的重要組成成分，主要的細胞類型是神經元和膠質細胞。膠質細胞又分為星型膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞[1]。針對不同的類型，我們需要采取不同的感染策略。接下來小編將會就使用了我們的病毒的客戶文獻進行相關的分析。
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首先是神經元細胞，這篇文獻[2]中，作者主要是研究TFE3對于脊髓損傷（SCI）的影響。結果表明在SCI中，自噬會導致ER應激，增強ROS的產生。并且發現TFE3和ROS的水平呈反比。最后作者證明了SCI后TFE3的激活部分由AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信號傳導調節。表明TFE3是ROS介導的SCI后自噬功能障礙的重要調節因子，并且TFE3可作為開發SCI治療方法的有希望的靶標。
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在文章中，作者利用AAV-TFE3 shRNA對目的基因實現了干擾表達的效果，通過脊髓原位注射的方式靶向脊髓內的神經元。在這里因為是干擾AAV，作者采用了組成型的U6啟動子+AAV9的構建方式。注射的滴度和用量分別為2.26E+13vg/ml,2μl。結果表明在SCI模型鼠中加了TEF3 shRNA的小鼠的神經元中p62的密度顯著增強，解釋了部分機制。
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接下來這篇文獻依然是靶向神經元的相關文獻[3]，這里采用的是鞘內注射的方式。這篇文獻針對脊髓背角神經元和疼痛之間的關系進行了研究。結果表明在db/db的小鼠脊髓背角中，SIRT1表達降低會伴隨著結構突觸可塑性的增強。通過SIRT1的激動劑SRT1720上調SIRT1可以緩解疼痛行為。通過對SIRT1進行干預，證明STIR1可以通過調節脊髓背角神經元的突觸可塑性來影響神經疼痛。
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在這篇文章中，作者將AAV-Cre-EGFP鞘內注射到SIRT1flox/flox小鼠中，作者采用了hSyn+AAV9的構建方式，靶向到脊髓的神經元。注射滴度和體積分別為4.7E+10vg，10μl。結果表明STRI1的敲除會誘導疼痛行為并且增強脊髓背角神經元的突觸可塑性。
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對于星型膠質細胞而言，血清型和啟動子比較特殊一點。接下來的這篇文獻[4]靶向的就是脊髓的星膠，采用的是髓內多位點注射的方式，注射滴度和體積分別為4E+9 vg/位點,1μl，共4個位點。在這篇文獻中，作者比較了AAV血清型的轉導效率。并且驗證了GfaABC1D啟動子的靶向性。結果表明GfaABC1D+AAV5的方案能夠最好的達到星型膠質細胞的靶向性。
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在靶向少突膠質細胞的AAV注射上，下面這篇文獻[5]采用的是吉凱基因的AAV9搭配廣譜性的CMV，雙側髓內注射的方式，滴度和體積分別為1.04 E+13vg/ml，0.5μl來實現骨形態發生蛋白（BMP7）的過表達。BMP7可減少神經元的丟失，誘導軸突再生。研究表明γ氨基丁酸在誘導SCI大鼠的少突膠質細胞的生成中發揮了重要的作用，可能與BMP7在少突膠質細胞中的上調有關。作者通過用AAV過表達BMP7，證明了BMP7對TNF-α誘導的少突膠質細胞凋亡的保護作用。
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ANXA3在脊髓小膠質細胞中高度表達，并且在骨癌誘發疼痛（BCP）期間上調。但是，小膠質細胞在BCP發生和發展的過程中的作用以及潛在的分子機制不清楚。這篇文獻[6]利用AAV-shANXA3在骨癌誘導前進行鞘內注射，進一步進行疼痛行為指標的檢測。采用的策略是AAV9+CMV的搭配方式，采用鞘內注射的方式對小膠質細胞進行感染。結果發現，ANXA3在小膠質細胞中表達，并且在BCP期間顯著增加。ANXA3的敲除可以逆轉疼痛行為但是不能阻止疼痛的發生和發展。
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綜上，我們可以看到靶向脊髓的細胞可以有神經元特異性的啟動子hSyn，廣譜性的啟動子CMV，星膠特異性的啟動子GFAP，對于小膠質細胞而言也可以用小膠特異性的啟動子F4/80，血清型多選用使用最為廣泛的9型。下面是對各種細胞進行的相關總結：
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細胞類型 |
啟動子 |
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神經元 |
hSyn |
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星型膠質細胞 |
GFAP / GfaABC1D |
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少突膠質細胞 |
CMV |
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小膠質細胞 |
CMV / F4/80 |
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參考文獻…
1.Zhang, Q., et al., Single‐cell analysis reveals dynamic changes of neural cells in developing human spinal cord.?EMBO reports, 2021. 22(11).
2. Zhou, K., et al., TFE3, a potential therapeutic target for Spinal Cord Injury via augmenting autophagy flux and alleviating ER stress.?Theranostics, 2020. 10(20): p. 9280-9302.
3. Zhang, Z., et al., Sirtuin 1 alleviates diabetic neuropathic pain by regulating synaptic plasticity of spinal dorsal horn neurons.?Pain, 2019. 160(5): p. 1082-1092.
4. Griffin, J.M., et al., Astrocyte-selective AAV gene therapy through the endogenous GFAP promoter results in robust transduction in the rat spinal cord following injury.?Gene Therapy, 2019. 26(5): p. 198-210.
5. Liu, S., et al., Overexpression of bone morphogenetic protein 7 reduces oligodendrocytes loss and promotes functional recovery after spinal cord injury.?Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2021. 25(18): p. 8764-8774.
6. Zhang, Z., et al., Microglial annexin A3 downregulation alleviates bone cancer-induced pain through inhibiting the Hif-1α/vascular endothelial growth factor signaling pathway.?Pain, 2020. 161(12): p. 2750-2762.