表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達的可遺傳的變化的一門遺傳學分支學科。DNA甲基化(DNA methylation)、組蛋白修飾(histone modification)、基因組印記(genomic imprinting)、RNA編輯(RNA editing)、基因沉默、核仁顯性、休眠轉座子激活和性別相關性基因劑量補償效應等都是典型的表觀遺傳現象。表觀遺傳調控研究技術分為轉錄前調控研究技術和轉錄后調控研究技術。轉錄前調控研究技術主要包括：MSP、BSP、ChIP、EMSA、DNA Pull down、酵母單雜交（Y1H）；轉錄后調控研究技術主要包括RIP、RNA Pull down 、雙熒光素酶報告系統等。
本文以《RUNX1 regulates site specificity of DNA demethylation by recruitment of DNA demethylation machineries in hematopoietic cells》一文為例從轉錄因子甲基化調控角度為您介紹表觀遺傳的技術方法和思路的應用。
文章概要：RUNX1在造血細胞發生過程中是一個關鍵的轉錄因子，同時在免疫功能中扮演著重要的角色。盡管以前對RUNX1的基因表達調控機制進行了大量的研究，但是關于RUNX1在表觀遺傳調控中的作用知之甚少。本文證明了RUNX1在人類造血細胞中直接促進了結合位點的去甲基化。然而在DNA復制阻滯的細胞里面RUNX1同樣發揮去甲基化的作用，說明了RUNX1激活了相關的去甲基化機制。同時，免疫共沉淀實驗驗證了RUNX1與DNA去甲基化酶（TET2/TET3/TDG）的相互作用。染色質免疫共沉淀（ChIP-seq）技術揭示了RUNX1和TET2在相同基因組區域的共定位。最后，運用甲基化組分析了造血細胞發生過程中去甲基化區域RUNX1結合位點的分布。
為了研究RUNX1與對甲基化的調控作用，作者在細胞中過表達RUNX1，采用芯片技術檢測了異位表達RUNX1的細胞的DNA甲基化水平。作者鑒定了145個去甲基化位點和59個甲基化位點，同時發現異位表達的RUNX1促進了RUNX1位點的去甲基化。通過RUNX1的結合基序，設計TF-binding motif過表達實驗，證明了RUNX1結合基序主要出現在去甲基化區域，而不是在甲基化區域，證明了RUNX1是通過位點結合來定位去甲基化區域的。
進一步的ChIP實驗驗證了RUNX1結合位點和去甲基化CpG島的結合位點的重合性及。
而更直接的重亞硫酸鹽測序結果也顯示過表達的RUNX1促進了PTPN22和RUNX3的去甲基化。
以上這些方法都顯示了RUNX1通過位點特異性結合來定位去甲基化區域的。那么RUNX1引導位點特異性去甲基化與DNA的合成有無關系呢？作者采用了DNA合成阻滯劑mitomycin C處理細胞，qMSP（實時定量甲基化測序）檢測在DNA阻滯的情況下DNA關鍵位點的甲基化情況，發現RUNX1引導的特定位點甲基化有受DNA復制影響和不受DNA復制影響兩種機制的共同作用。
甲基化分為主動的去甲基化和非主動的去甲基化，主動的是位點特異性指導的，而被動的去甲基化則是在去甲基化相關酶作用下進行的。以上是RUNX1主動去甲基化的研究，作者進一步研究了RUNX1在主動去甲基化中的作用：TET蛋白在主動去甲基化中發揮重要作用，作者首先研究了RUNX1與TET的相互作用，發現TET可以促進RUNX1調節的DNA的去甲基化作用。
而它們作用的機制如何，作者進一步通過分子互作技術CO-IP和缺失突變的RUNX1進一步做了如下的研究。
CO-IP（HT）技術證明了RUNX1與TET2、TDG、GADD45A是相互作用的。RUNX1哪個區段在這個過程中起作用？作者構建了RUNX1缺失突變體，用CO-IP和qMSP技術分別檢測了不同突變體的去甲基化作用，弄清了RUNX1中各個功能區段發揮的作用.
RUNX1可以和TET2相結合，那么RUNX和TET2相結合是否共同定位于特定位點而促進去甲基化作用的呢？作者進一步做了RUNX1和TET2的ChIP-seq實驗，驗證了兩者ChIP峰的高度重疊，證實了兩者基因組水平的共定位去甲基化作用。
這樣作者對RUNX1的去甲基化機制做了較詳盡的闡述，回到造血細胞的分化過程，作者對造血細胞發生過程做了全基因組的甲基化分析，發現RUNX1結合位點在造血細胞發生過程中顯著性地聚集在去甲基化區域，RUNX1在造血細胞發生過程中通過去甲基化作用促進了相關的過程。
文章總結：作者補充研究RUNX1的非轉錄子作用，首先通過過表達和芯片技術驗證了RUNX1的去甲基化作用，并且通過ChIP-seq、BSP、MSP等技術證明了RUNX1通過結合特定的序列指導DNA的去甲基化作用。然后，從去甲基化的途徑出發，作者接著從主動去甲基化出發，通過CO-IP實驗驗證了RUNX1是與關鍵分子TET2等的相互作用，TET2促進了RUNX1的去甲基化作用，找到了RUNX1去甲基化的作用途徑。最后，通過芯片等技術，作者從甲基化功能角度對造血細胞發生過程進行了由RUNX1指導的甲基化調控作用的研究，證實了RUNX1指導的全基因組的甲基化在造血細胞發生過程中具有重要的作用。
文章中主要使用的實驗方法：
1. 細胞培養、轉染
2. 甲基化芯片檢測與甲基化分析
3. 甲基化位點檢測：ChIP-seq、qBSP、qMSP
4. 病毒包裝與感染
5. 分子檢測、互作：q-PCR、WB、CO-IP、HT-CO-IP（標簽）
6. 突變基因合成、基因敲除
解析文獻：
Suzuki T, Shimizu Y, et al. RUNX1 regulates site specificity of DNA demethylation by recruitment of DNA demethylation machineries in hematopoietic cells. Blood advances, 2017, 1(20):1699-1711.
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