采用大規模泛素化分析技術探索水稻葉片中的泛素化位點
—— 泛素化肽段富集+高精度質譜系統
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Comparative Profiling of the Rice Ubiquitome Reveals the Significance of Lysine Ubiquitination in Young Leaves. J Proteome Res. 2015; 14(5): 2017-25.
蛋白質泛素化是一種廣泛存在的蛋白質翻譯后修飾形態，對真核生物的生長發育、細胞凋亡、環境應答以及其他很多重要的生物學過程具有顯著的調控作用。盡管水稻中已經有少數幾個泛素化蛋白質被發現，但是因為技術手段的限制，大規模的泛素化位點及泛素化程度的分析研究則尚未見報道。
本次研究結合高靈敏免疫親和富集技術以及高精度質譜系統首次對水稻進行了大規模泛素化位點分析，在水稻葉片中發現了來自464個蛋白質的861個含di-Gly-Lys?結構的泛素化位點。生物信息學分析發現，這些泛素化蛋白質在細胞內具有不同的亞細胞定位，以及多種類型的功能，主要與binding?以及?catalytic activity相關，同時還發現這些泛素化位點可以歸結為7個保守的motif。蛋白質互作網絡和KEGG分析顯示泛素化可以廣泛調節水稻中的信號通路和代謝通路。本次研究證明了大規模泛素化分析技術（泛素化肽段富集+高精度質譜系統）可以有效地對植物的泛素化狀態進行大規模的分析。同時該研究發現了464個泛素化蛋白質，為進一步研究這些泛素化蛋白質在水稻體內的生物學功能奠定了基礎。
Figure 1. Schematic diagram of a strategy for the global identification of ubiquitinated peptides in rice.
泛素是76個氨基酸大小的蛋白質，泛素化修飾可以以多種形式存在，泛素化修飾結構和修飾位點都非常復雜。在蛋白質的酶解過程中，經Trypsin酶解后泛素分子會被切除而在被修飾的Lys上留下兩個Gly，從而形成di-Gly-Lys的結構。針對該結構可采用相應的抗體特異性富集被泛素化的肽段，再結合高精度質譜系統即可對被富集下來的泛素化肽段進行定性和定量分析。本研究即采用該技術路線對水稻幼苗葉片進行了大規模泛素化分析。
本研究共找到了464個泛素化蛋白質中的861泛素化位點。
GO功能注釋：發現這些泛素化蛋白質在細胞內具有多種多樣的細胞定位，并且與廣泛的生物學過程密切相關。從分子功能角度出發，盡管發現這些泛素化蛋白質與多種分子功能相關，但絕大部分確與binding（229個蛋白質） 以及?catalytic activity（196個蛋白質）相關。
Figure 2.?Gene ontology functional characterization?of the identified ubiquitinated proteins. (A) Distribution of the ubiquitinated proteins in terms of?biological processes. (B) Distribution of the ubiquitinated proteins in terms ofmolecular functions. (C) Distribution of the ubiquitinated proteins in terms of?cellular components.
Motif分析：有關人類的研究發現泛素化位點并不會像磷酸化位點一樣具有比較保守的motif，但對水稻中的這些泛素化位點進行motif進行分析，發現這些位點可以歸結為七個可能的motif，分別為AAXXXXKub, AXXXXXKubXA, AXXXKub, AKub, EKub, KubXXA, and AXKub，這也說明植物與動物的泛素化位點結構存在一定的差異。
Figure 3. Ubiquitinated lysine motifs in rice. (A) Ubiquitination motifs and the conservation of ubiquitination sites. The height of each letter corresponds to the frequency of that amino acid residue in that position. The central K refers to the ubiquitinated lysine. (B) The number of identified peptides containing ubiquitinated lysine in each motif.
蛋白質互作網絡分析：發現水稻中的泛素化蛋白質可影響鈣調節過程，并與14-3-3家族蛋白質有密切聯系。
Figure 4. Interaction networks of ubiquitinated proteins associated with calcium sensors (A) and 14-3-3 proteins (B,C). Ubiquitinated proteins are highlighted in yellow.
KEGG通路注釋：顯示464個泛素化蛋白質中的有234個與195個代謝通路相關，其中比較主要的有glycolysis/gluconeogenesis、photosynthesis等途徑，說明泛素化對調節水稻的生長發育具有十分顯著的作用。
Figure 5. Ubiquitinated proteins in representative metabolic pathways in terms of glycolysis/gluconeogenesis in the rice cultivar Nipponbare. Ubiquitinated proteins are highlighted in green.
本研究首次利用免疫親和富集技術結合高精度質譜系統的路線在水稻中進行大規模泛素化位點分析，不僅證明該技術路線在植物中同樣適用，也發現了水稻中的大量泛素化蛋白質和泛素化位點，為水稻體內的泛素化狀態研究積累了大量的數據，也為水稻體內泛素化蛋白質的生物學功能研究奠定了基礎。
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