編者按
類器官是指由干細胞或器官祖細胞誘導分化并經體外3D環境培養的細胞簇。與傳統的細胞培養相比，類器官能夠自我更新和自組織，包含多種類型的器官特異性細胞，具備主要組織或器官的三維結構與生理功能，因此在長期擴增的同時也能保持穩定的基因和表型特征，在發育生物學、疾病建模、藥物研發和再生醫學等研究中有著廣泛的應用前景。
然而大部分的類器官缺乏血管網絡的支持，嚴重限制了其形態大小和發育狀態，在這樣培養條件下構建的類器官無法完全模擬人體內真實的組織器官，而目前僅有少量培養成功的血管化類器官，因此類器官的血管化仍是該領域尤待解決的重要問題之一。
今天我們來分享一篇2023年2月的綜述文章——《血管化類器官的構建思路與技術挑戰》，本文總結了現有的體外構建血管化類器官的技術體系，并系統論述了血管化在類器官中的作用，以期為類器官的科學研究和臨床應用提供新思路。
文章題目
血管化類器官的構建思路與技術挑戰
雜志：《中國比較醫學雜志》
發表時間：2023年第2期|126-133
作者：孫珂; 王婷; 李靜頤; 李紅梅
單位：北京中醫藥大學生命科學學院
01、血管發生與血管生成
血管是由內膜、中膜和外膜三層結構組成，內膜主要由血管內皮細胞構成，外被平滑肌細胞和最外層的成纖維細胞、疏松結締組織等包圍，既維持了結構的穩定性，又能夠調節血管的直徑以適應血流的變化，是哺乳動物體內最重要和最復雜的器官之一。作為胚胎發育過程中形成的第一個功能性器官，血管形成的多功能運輸網絡，在組織氧合、新陳代謝和免疫監視等過程中發揮著關鍵作用，有助于組織器官的發育并促進其再生，以維持生命體的生長和活力。
內皮細胞是構建血管的“基石”，廣泛參與到血管網絡的生成中，主要包括血管發生和血管生成兩個過程。血管發生是血管祖細胞或內皮母細胞經歷激活、增殖、遷移、排列、管狀形成、分支，聚集形成毛細血管叢的過程。該過程主要活躍在胚胎發生的第一階段。而血管生成是現有血管形成新的毛細血管的過程，包括血管內皮細胞的激活、增殖、遷移等，在胚胎發育的后期和成年階段占主導地位，同時伴隨多種促血管生成因子、抑血管生成因子、缺氧等的刺激、多種酶的分泌，水解重構基質，最終形成豐富的管腔結構，確保胚胎的存活和發育。
Lammer等將胚胎小鼠的內胚層分離，并與不同的組織共培養，結果表明只有主動脈內皮細胞的存在才能夠增強胰島素的產生。Matsumoto等的研究顯示在新生肝細胞旁有內皮細胞的標志物存在，并且促進了肝竇毛細血管和肝芽的遷移和生長，證實了內皮細胞可促進新生血管和器官的發生，尤其在器官發生早期階段至關重要。
同樣，在大腦皮層的發育中，腦部微血管內皮細胞有利于祖細胞分化為神經元，并且能夠合成細胞外基質以調節神經元的遷移和血腦屏障( blood brain barrier,BBB)的建立，參與胚胎和神經干細胞的維持和更新。因此，內皮細胞和新生器官之間的這種緊密聯系，也表明了其在組織和器官的成熟和圖案化中起著關鍵性作用。
02、類器官與血管化研究
與傳統的動物模型和2D細胞培養相比，自體干細胞分化的3D類器官更符合倫理要求，能夠反映細胞與細胞、基質間的相互作用關系，可較為精準地模擬出人體復雜的生理病理過程。直至今日，已有諸如小腸、腦、肝、胰島、腎、視網膜等組織的類器官構建成功，但其研究也主要集中于疾病模型的構建。
然而，目前體外開發的類器官由于缺少血液循環，營養和氧氣難以到達核心部位，代謝廢物持續增加，在培養后期引起廣泛的細胞死亡和過早的細胞分化，其發育階段和功能也類似于胚胎或胎兒器官而不是成人器官，缺少相關的發育信號，形態大小和成熟度嚴重影響了類器官的研究與應用。
為了克服這一限制，一些研究者將類器官移植到免疫缺陷的小鼠體內，發現移植后的類器官中有宿主來源的血液灌注，并且無論是類器官的大小、 成熟度還是存活時間都有了極大的改善，可見類器官的血管化可能是解決類器官中氧氣和營養分布的關鍵，類器官中的血管系統能通過旁分泌信號傳導促進類器官的成熟，但目前體外 血管化類器官構建仍存在不小的技術難度，當下不斷涌現的人工構建血管化相關研究(見表 1)，為實現類器官內血管生成提供了堅實的前期基礎。
圖1
2. 1 腦類器官的血管化研究
人腦是生物體中結構最復雜、功能最完善的器 官之一，是中樞神經系統的主要部分，脊椎動物的中樞神經系統和血管系統發育是同步進行的，發育中的中樞神經系統不產生血管祖細胞，而未血管化的腦類器官在移植宿主的體內無法存活，因此血管化對于營養、氧氣的供應及神經元的健康發育尤為重要。
目前有許多學者嘗試構建血管化的人腦類器官Pham等將同一患者來源的人誘導多能干細胞 (human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)衍生的血管內皮細胞與腦類器官共培養，移植到免疫缺陷小鼠體內的當天，發現在類器官周圍 有內皮細胞標志物CD31的存在，隨著腦類器官在體內進一步發育成熟，熒光染色結果顯示在類器官周圍有連續性內生化血管網絡結構的形成，并有新的血管向類器官核心部位滲透，為腦類器官血管化研究提供了產生內源性血管化全腦類器官的新方案。
Shi等在體外通過將人胚胎干細胞或hiPSCs 和人臍靜脈內皮細胞 ( human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)共培養，在一定程度上誘導 HUVECs 向腦微血管內皮細胞分化，并且形成一個發育良好的網狀或管狀血管系統,建立的新的血管化腦類器官可在體外長時間培養(超過 200d)，移植后的腦類器 官中血管網絡可和宿主的血管相連接形成新的功能性血管網絡。隨著類器官技術的提高和3D類血管的構建成功，除了與內皮細胞的共培養，3D類血管與其他組織的類器官共培養也逐漸引起人們的關注。
Ahn等將hiPSCs誘導分化而成的3D類血管和腦皮質類器官共培養，通過5%胎牛血清的誘導，第13天形成的腦類器官表面表達CD31，有典型的血管樣結構和神經樣網絡存在，并且表達BBB的典型標志物，在體外可維持50d。Sun等同時將 hESCs 誘導分化為3D類血管和腦類器官，并且在3D類血管中加入特定神經營養因子，使其具有腦血管的特征，隨后將二者共培養，40d后發現類器官中形成完整的血管組織，與神經組織緊密連接并形成BBB結構。
除了以上方案，部分研究者在不依賴外源性細胞的情況下構建血管化腦類器官。血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor,VEGF) 是血管發育的關鍵細胞外因子，可促進ESCs向內皮細胞分化并產生管狀結構的組織，同時還能夠培養神經元的神經突起生長和存活，引導發育中大腦的神經元遷移。Ham 等在類器官的培養中添加VEGF，結果表明VEGF在不減少胚胎神經元的情況下增強了血管內皮細胞的分化，成功構建出具有開放性血管結構的大腦類器官，測序數據也驗證了該結果。
人ETS 變體2(human ETS variant 2,hETV2) 轉錄因子與人血管內皮細胞的形成高度相關，Cakir 等設計了一種表達 hETV2 的人類胚胎干細胞，誘導該細胞分化成為帶血管蒂的人皮層腦類器官，并表達緊密連接蛋白和營養轉運蛋白、跨內皮細胞電阻表達增加等BBB的特征。BBB主要由連接的內皮細胞與緊密連接蛋白 構成,是大腦和血液循環之間的一種高度選擇性和動態的親脂屏障，維持著中樞神經系統的穩態。不少學者也通過培養BBB類器官來滿足對其的研究。
Hatherell 等通過使用Trans-well系統來模擬BBB，內皮細胞生長在頂膜上，星形膠質細胞加入基底膜形成共培養，然后將周細胞加入培養板中，形成三層培養，同時在培養基中補充人源血清，成功構建BBB 三維體外模型。Bergmann 等 和張雷采用類似的培養方案，將人腦內皮細胞、周細胞和星形膠質細胞在低黏附的調節下共培養，可在2~3d內使其自組裝成類似BBB的球體，并且可具有緊密連接蛋白、轉運蛋白和藥物代謝等BBB的典型功能。
2. 2 心臟類器官的血管化研究
心臟是一個中空的器官，主要由4個腔、4個瓣膜以及5根大血管構成，自身的血液供應由兩條冠狀動脈保證，同時心臟也是多細胞器官，主要包括心肌細胞、心臟成纖維細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞，共同協作以實現功能的正常發揮。心臟類器官的研究進展緩慢，也與其結構的復雜性相關。
(1) Filippo Buono等首次采用三培養的方案，即將不同來源的心肌細胞、人心臟微血管內皮細胞和人心臟成纖維細胞在單細胞懸浮液中按照3∶5∶2的生理細胞比例構建心臟類器官，在培養的第21天觀察到有緊湊且輪廓分明的球形結構形成，呈現出較為明顯的收縮活性，并且可根據人類心臟的不同發育階段對具體的培養方案進行調整。該方案操作簡便，構建的心臟類器官具有高收縮性，但就結構而言，與體內的心臟仍有較大的差異。
(2) 鑒于成纖維細胞生長因子( fibroblast growth factor, Fgf)4 和包含層粘連蛋白的細胞外基質在器官發生和心臟發育中的重要作用，Lee等將來自小鼠 ESCs 的擬胚體培養在含有Fgf4培養基的凝膠化層粘連蛋白—內膜素復合物包被的室載玻片上，培養10d后可觀察到具有多個腔室結構的心臟類器官形成，伴有明顯的收縮行為，并表達胚胎心臟的相關基因和結構。
(3)Han等將不同密度的心臟干細胞(cardiac stem cells,CSCs)播種在超低附著多孔 板中，培養3d后，與CSCs相比，形成的CSCs球體具備更強的分泌功能和心肌細胞分化能力以及更高的心肌細胞相關標志物的表達，將3D球體注射到大鼠的缺血心肌中，發現缺血的心肌中有明顯的新生血管生成，可促進心肌修復。
2. 3 肝類器官的血管化研究
肝是人體最大的實質性臟器，由幾種不同胚胎起源的細胞類型組成，包括肝細胞、膽道上皮細胞 (膽管細胞)、星狀細胞、Kupffer細胞和肝竇內皮細胞，共同執行營養素和藥物代謝、循環血量和免疫系統調控、生長信號通路的內分泌控制、脂質和膽固醇穩態等多重功能來維持機體穩態。
肝類器官的血管化研究大部分是與不同的內皮細胞共培養。2013年，Takebe 等在體外將 hiPSCs誘導形成的肝內胚層細胞與HUVECs、人骨髓來源的間充質干細胞共培養以自組織形成具有三維球狀結構的肝芽，移植到小鼠體內48h后觀察到移植的肝芽血管與宿主的血管相互連接，形成的功能性血管網絡促進了肝芽的成熟,能夠執行分泌蛋白質、儲存糖原、藥物代謝等肝特異性功能，這也是第一個從 多能干細胞中產生功能性人體器官的研究。
Pettinato 等將人脂肪微血管內皮細胞與hiPSCs誘導分化的擬胚體按照1∶ 3的比例共培養形成的肝細胞樣細胞( hepatocyte-like cells,HLCs)，與單獨 hiPSCs 誘導分化的HLCs相比，具備更穩定的肝功能和更高的肝細胞基因和蛋白，同時 hiPSCs分化為HLCs的能力和效率大大提高，可滿足臨床大量的需求。
肝祖細胞(liver progenitor cells,LPCs)位于膽道上皮內，具有產生肝細胞和膽管細胞的雙電位能力，可以長期維持，不會去分化和功能喪失，肝含有高度專業化的肝血竇內皮細胞( liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)，可指導肝發育和再生,Yap 等改進培養方案,將小鼠 LPCs 與小鼠 LSECs 按 照 1 ∶ 1 的比例共培養,構建的血管化類器官具有肝 特有的血管系統,同時包含肝實質細胞和膽管細胞。
2. 4 腎類器官的血管化研究
腎通過生成尿液、排泄代謝產物、調節體液及內分泌等功能，維持機體的生理穩態。與其他器官相比，腎是高度血管化的臟器，具有最豐富和最多樣化的內皮細胞群體，保障了腎的正常發育和生理功能的正常發揮。
在腎發育的早期就有血管祖細胞的存在，因此在腎類器官的培養中有內皮細胞的存在，但缺乏功能性血管網絡的形成。鑒于人多能干細胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)衍生的腎類器官能夠自發分泌VEGF,Low等在不使用外源性 VEGFA的條件下，通過對WNT信號傳導的動態調節，有效地控制了類器官內近端腎小球與遠 端腎小管的相對比例，進而調控近端足細胞釋放VEGFA的水平，誘導hPSCs 分化為血管化的3D類器官，其結果也表明足細胞分泌的VEGFA能夠將腎發育早期的血管祖細胞催化成為更成熟的內皮細胞，形成常駐的血管網絡。
2. 5 腸類器官的血管化研究
腸是指從胃幽門至肛門的消化管，哺乳動物的腸包括小腸、大腸和直腸三部分，具有消化、吸收、 免疫調節等功能，自2009年Hans Clevers研究團隊首次利用小鼠LGR5+小腸干細胞在體外培養出小腸類器官以來，腸道類器官模型被廣泛應用于腸道相關疾病研究領域，但現有的培養方案并不能完全概括人類天然腸道的復雜性。
Holloway等在研究中發現 hPSCs誘導分化的腸道類器官在早期階段會大量的內源性內皮樣細胞，隨著時間的推移, 其數量反而逐漸減少，為了在長時間內維持并促進內皮細胞的存活,研究者改進現有方案,在培養基 中加入表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)、 VEGF、 Fgf2、 骨形態發生蛋白 (bone morphogenetic protein,BMP)4 等誘導和維持血管的生長因子以誘導hPSCs分化形成血管化的小腸類器官,結果也證實在新的培養體系中,內皮細胞也可長期存在。
2. 6 3D類血管與類器官的融合研究
在眾多疾病當中，血管的病變會導致組織的缺血缺氧，是其重要并發癥之一，同樣也能導致患者的死亡?，F階段大部分血管化類器官的構建只是初步分化出一個血管樣結構，甚至只是大量 2D內皮細胞的堆積，尚不能在體內重建完整的血管結構，行使血管的職能，也不能滿足循環灌注的需求。
基于此，英屬哥倫比亞大學Wimmer等先把iPSCs誘導分化為血管內皮細胞，隨后在3D環境中繼續培養，使原本沒有結構可言的2D細胞層形成具有類血管結構的3D類血管組織，首次實現了將iPSCs成功誘導為3D血管。這些類血管包含內皮 細胞、周細胞及毛細血管網絡,甚至在分子水平上 與人類毛細血管相似，并在移植到小鼠體內后發現，這些類血管能夠發育成包含毛細血管、靜脈和動脈的完整的血管系統，可以充分模擬人類血管的結構與功能，而暴露在疾病環境中時，這些類血管也能夠出現與疾病患者的血管相類似的病變特征，這意味著該類血管可模擬正常與病理情況的血管 狀況,為血管疾病提供了高水平的細胞模型 。
03、基于微流控的血管化類器官技術優化
隨著科技的進步和類器官的發展，現有的血管化類器官構建方案的缺陷也逐漸暴露出來，目前血管化的類器官制備方案主要集中于和不同的內皮細胞共培養研究。然而，用于共培養的內皮細胞大部分缺乏與其他體細胞相互作用的能力，難以反映和用于體內內皮細胞與周圍細胞的互相作用及相關機制研究。
此外，僅憑借單獨的內皮細胞，難以形成由多種細胞構成的完整的血管結構，并且缺乏動 態的灌流培養，無法模擬體內血流對血管的沖擊，反映血流動力學對組織器官的作用。
在培養過程中，類器官的形態不等、大小不一，可重復性差，也存在培養成功率較低、成本高昂等問題，給血管化類器官的培養和標準化帶來了挑戰。有部分學者在由iPSCs誘導分化的心臟類器官中，通過3D打印技術將血管網絡打印其中，構建出的心臟類器官可實現長時間的灌注，但其收縮力與體內的心臟相比差距過大，還需進一步的技術優化。
基于此，現有的血管化類器官制備中也有將3D類血管與其他類器官共培養，管解離成團塊與大腦皮質類器官共培養，發現3D類血管產生的血管細胞能夠穿透腦類器官，形成神經特異性血管網絡，并可長期維持；Sun等將3D類血管和腦類器官共培養，同樣在融合后的組織中發現有類似于BBB的結構。
但在目前的研究中，3D類血管僅限于與腦類器官進行共培養，并且尚未進行血液灌注的研究，也難以模擬血管環境，同時在所有組織類器官(包括3D類血管)的培養過程中，尚未有標準化培養體系，可重復性低；在所有的共培養體系中，從不同胚層衍生的3D類血管和其他類器官的融合仍有一定難度，仍需要進一步的探索。
而微流控體系能夠模擬動態灌流，將微流控技術與3D類血管相結合，在有血管結構的基礎上，輔以灌注功能，充分模擬真實的血液灌注，為上述問題的解決帶來希望。微流控技術是集工程學、生物學、醫學等多學科為一體的新型技術，將研究樣本通過多重單元技藝集中于整體可控的微米尺寸芯片上，輔以流體的沖刷作用，完成培養和分析全過程，在構建復雜精確的組織器官等領域有著廣大的應用前景。流體在微流控通道中存在的層流現象，可實現材料、化學環境和細胞在通道中的有序排布。
基于微流控技術構建的血管化類器官系統，可滿足灌流培養對內皮細胞的作用，促進多種細胞因子的分泌與釋放，實現在不同流速下的同時灌流，充分模擬體內的不同類型血管和不同生理、病理條件下血管中的血流關鍵特征，與實際的器官組織更為接近。
直至目前，已有部分學者進行了類器官與微流控技術相結合的研究:
(1)腎類器官中血管的發育在靜態培養中受到限制，因此Homan等將被細胞外基質包裹的發育中的腎類器官，置于可灌注的微流控芯片上，通過高流體剪切力，逐漸發育成熟，成功構建出具有壁細胞支持的可灌注管腔的腎類器官。
與靜態對照相比，流動培養的血管化腎類器官具有更多成熟的足細胞和腎小管區室、更高的細胞極性和成體基因表達，強調了流體剪切力是體外腎類器官血管形成的關鍵因素。
(2)為了構建更貼近生理狀態的肝模型對中藥注射液進行肝毒性評估，朱麗穎等采用可長期培養并模擬血管內皮剪切力的HUVECs來模擬血管。通過微流控技術模擬血液流動的力學微環境，并結合3D打印技術構建出的肝微球，成功構建出功能性血管化的人源肝類器官，并且通過該模型為3種活血化瘀中藥注射劑提供了更為準確的肝毒性評價，實現藥物的高通量篩選和數據處理。
(3) 楊雅敏等等基于微流控技術創建出深度為100μm、寬度為0. 079~0. 593 mm的3D微血管模型，不僅具備擴張、囊狀、曲折、 分支不規律、直徑不均勻等血管特征，而且將10%兔紅細胞溶液注射入芯片中，結合激光散斑血流成像系統，可觀察到溶液的流速分布隨著血管的粗細、曲折、密度不同而發生變化，滿足多種研究的需求。
(4) Ronaldson-Bouchard等開發了一種即插即用、只有顯微鏡載玻片大小的多器官芯片，將成熟的人類心臟、肝、骨骼、皮膚組織通過血管流動和循環免疫細胞相連，在體外再現了相互依賴的器官功能。
04、血管化類器官存在的問題與展望
類器官的血管化一直是再生醫學領域研究的熱點與難點，盡管近年來已取得巨大的進步,但依然有部分關鍵問題存在:
(1) 體外的細胞系如HUVECs依然廣泛用于血管化研究，HUVECs易于處理、成本低廉，是血管化建模的首選，但人原代內皮細胞的來源有限，且難以支撐器官的特異性結構，單從制備的角度來說對血管化類器官的機制研究產生了不同程度的限制；
(2)雖然可通過微流控等工程技術構建血管化類器官，但在現有的培養方案中,血管結構的尺寸和密度與體內的血管結構相差過大，并且只能作為短期研究，在穩定性和長期性方面仍然缺乏可重復性好的技術方案。
基于上述問題，可通過結合新型3D生物打印技術，體外構建外循環系統，與類器官內部生成的血管實現端口吻合，通過AI自動化裝備實現內外循環和代謝的智能化、可視化調控，有望開發出具有功能性血管網絡、發育成熟的血管化類器官，助推我國醫藥研發和產業化進程。
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