本文介紹伴刀豆球蛋白A，及其與磁珠共價(jià)偶聯(lián)后的ConA磁珠的應(yīng)用場(chǎng)景。
伴刀豆球蛋白A磁珠 （Concanavalin A-Coated Magnetic Beads，簡(jiǎn)稱ConA磁珠），顧名思義，就是植物凝集素伴刀豆球蛋白A（ConA）和超順磁性納米材料進(jìn)行偶聯(lián)的一種生物磁珠。下面將逐一介紹有關(guān)ConA磁珠的那些事兒。
01
伴刀豆蛋白A
伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A, ConA），是自1936年以來(lái)，第一個(gè)從刀豆（Canavalia ensiformis，洋刀豆）分離純化結(jié)晶的一種植物凝集素蛋白，無(wú)血型特異性。
ConA根據(jù)所處溶液pH值的不同，主要有2種形式：α-2 同源二聚體或 α-4 同源四聚體[2]。堿性條件下（pH>7.0）以四聚體（四個(gè)分子量為26kDa亞基構(gòu)成）形式存在；酸性條件（pH 4.5-5.5）下，Con A解離為活化的二聚體結(jié)構(gòu)（52kDa）。除此之外，ConA的功能受二價(jià)陽(yáng)離子的影響，如在缺乏金屬離子（Ca2+ 和 Mn2+ ）的情況下，其構(gòu)象、糖蛋白結(jié)合功能是無(wú)法得到發(fā)揮[1]。
圖1.ConA分子模型(A) ConA monomer, (B) ConA dimer, (C) ConA tetramer with mannose, glucose and metal ions
02
磁 珠
生物磁珠是一類具有納米粒徑大小，由高分子聚合物和無(wú)機(jī)磁性納米粒子形成的磁性微球。磁珠按照其結(jié)構(gòu)可以分為三大類：核-殼型結(jié)構(gòu)、夾層式結(jié)構(gòu)、彌散型結(jié)構(gòu)。磁性物質(zhì)有純鐵粉、羰基鐵、磁性礦、正鐵酸鹽、鐵鈷合金等。
磁性納米材料，因其具備特殊的效應(yīng)，如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等，在Fe3O4 納米顆粒的尺寸小于30 nm時(shí), 納米顆粒內(nèi)部熱騷動(dòng)的干擾表現(xiàn)顯著, 此時(shí), 這類納米顆粒就表現(xiàn)出一種特殊的磁學(xué)性質(zhì), 即超順磁性。超順磁性Fe3O4 納米顆粒具備優(yōu)質(zhì)的屬性，如無(wú)毒、良好的生物相容性、獨(dú)特的磁靶向特性以及在交變磁場(chǎng)中易于產(chǎn)熱等性質(zhì), 在生物行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。
而將ConA與微球進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)用于固定生物分子，則有以下優(yōu)勢(shì)：
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1. 共價(jià)偶聯(lián)結(jié)合穩(wěn)定性高，便于重復(fù)；
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2.配體ConA結(jié)合在微珠表面，可用于靶分子相互作用；
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3.溶液環(huán)境的動(dòng)力學(xué)特征，適合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作。
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03
ConA磁珠的應(yīng)用
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，ConA磁珠的主要應(yīng)用分為3種場(chǎng)景，分別是進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)膜分離、糖蛋白富集、和分離固定細(xì)胞方面。
應(yīng)用一
細(xì)胞質(zhì)膜分離
利用ConA磁珠受二價(jià)陽(yáng)離子的激活影響，使其存在于Ca²?和Mg²?溶液環(huán)境中，其具備的末端α-D-甘露糖基和α-D-葡萄糖基的親和作用功能，用在質(zhì)膜純化方面，是一種簡(jiǎn)便、高效的方式。如細(xì)胞或組織的質(zhì)膜分離，是進(jìn)一步獲取質(zhì)膜蛋白的關(guān)鍵步驟。而ConA是能結(jié)合細(xì)胞上糖基化蛋白，可利用此原理，獲取純度更高的質(zhì)膜。主要操作步驟為：通過(guò)將生物素化的ConA與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，將ConA固定在磁珠上；細(xì)胞膜與ConA磁珠孵育1h；磁力架上吸附；TBS洗滌5次；洗脫液洗脫細(xì)胞質(zhì)膜溶液[3]。
圖2. ConA磁珠純化質(zhì)膜步驟
應(yīng)用二
糖蛋白富集
ConA對(duì)甘露糖(mannose)和葡萄糖(glucose)具有特異性，且ConA識(shí)別α-連接甘露糖，這種甘露糖恰好是許多血清和細(xì)胞膜糖蛋白的“核心寡糖”。因此可用在免疫學(xué)等方面的分離細(xì)胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化分子。
主要操作步驟為：通過(guò)雙功能連接劑亞油酸雙- N-羥基琥珀酰亞胺酯 (DSS) 將氨基硅烷化的磁性納米微珠（ MNPs） 與ConA進(jìn)行交聯(lián)，獲取ConA磁珠；使用甲氧基乙二醇（MEG）終止磁性納米微球的非特異性結(jié)合，進(jìn)行磁分離；將加入用胰蛋白酶消化的細(xì)胞膜蛋白提取液，與ConA磁珠兩者孵育，磁力架收集已結(jié)合糖蛋白的ConA磁珠，洗滌非糖肽，最后洗脫捕獲的糖肽，進(jìn)行真空干燥。通過(guò)該方法，可以對(duì)腫瘤相關(guān)蛋白 (如EGFR) 的特定糖基化位點(diǎn)進(jìn)行深入分析[4]。
圖3. 超順磁性納米顆粒偶聯(lián)不同凝集素
應(yīng)用三
分離固定細(xì)胞
利用ConA磁珠（磁珠與高純度的伴刀豆球蛋白A共價(jià)結(jié)合）與細(xì)胞膜或核膜上的糖蛋白結(jié)合，從而捕獲細(xì)胞或細(xì)胞核，可實(shí)現(xiàn)少量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作可視化。如ConA磁珠用于用于研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的新型技術(shù)的CUT&Tag和CUT&RUN[5]實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ConA磁珠與細(xì)胞結(jié)合固定，實(shí)現(xiàn)可視化操作，避免離心帶來(lái)的細(xì)胞丟失問(wèn)題。
相對(duì)傳統(tǒng)研究DNA與蛋白互作的ChIP-seq技術(shù)，CUT&Tag和CUT&RUN具備以下優(yōu)勢(shì)：
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ConA磁珠與細(xì)胞膜糖蛋白結(jié)合，可視化操作，提升實(shí)驗(yàn)操作體驗(yàn)感；
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無(wú)需離心，只需要ConA磁珠吸附在磁力架上，即可完成細(xì)胞樣本和溶液的分離；
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可低至10個(gè)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)操作，規(guī)避ChIP-seq的大量樣本的需求。
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圖4. ChIP-seq，CUT&Tag，CUT RUN實(shí)驗(yàn)流程示意圖
04
翌圣ConA磁珠
翌圣自研ConA磁珠，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的原料篩選、多重工藝的優(yōu)化和改善，能夠快速、高效、靈敏、特異性地與糖蛋白、糖脂、多糖等帶有糖基化修飾分子結(jié)合。主要用于分離細(xì)胞或用于分離細(xì)胞或組織裂解液或血清中的糖蛋白等糖基化修飾分子等實(shí)驗(yàn)，特別直接用于CUT &RUN和CUT&Tag（ChIP-seq實(shí)驗(yàn)的革新性技術(shù)）等實(shí)驗(yàn)。
01
產(chǎn)品特點(diǎn)
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細(xì)胞捕獲效率>90%；
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穩(wěn)定的批次生產(chǎn)和較好的結(jié)果重復(fù)性；
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性能存放穩(wěn)定。
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02
產(chǎn)品信息
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貨號(hào) |
Cat#19810ES |
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規(guī)格 |
1mL/5mL/20mL |
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顏色 |
棕黃色 |
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磁珠濃度 |
10 mg/mL |
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固含量 |
9-11 mg/mL |
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磁珠尺寸大小 |
1 µm |
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載量 |
105個(gè)細(xì)胞/μL磁珠 |
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細(xì)胞捕獲 |
細(xì)胞捕獲率＞90% |
03
產(chǎn)品性能數(shù)據(jù)
單分散性
分別取競(jìng)品和翌圣ConA磁珠以及翌圣裸球原料各10µL，相同處理?xiàng)l件下，放大倍數(shù)10×/40×鏡下，翌圣ConA磁珠基本呈單分散性，相對(duì)競(jìng)品，未見(jiàn)明顯團(tuán)聚。
圖5. 單分散性結(jié)果圖
ConA結(jié)合細(xì)胞效果
相同數(shù)量細(xì)胞與磁珠結(jié)合孵育相同時(shí)間，細(xì)胞分析儀下自動(dòng)檢測(cè)ConA磁珠結(jié)合后剩余細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示翌圣ConA磁珠（Cat#19810）優(yōu)于競(jìng)品。
圖6. ConA磁珠結(jié)合細(xì)胞結(jié)果圖
細(xì)胞結(jié)合量與重復(fù)性
10µL翌圣ConA磁珠（Cat#19810）和10µL競(jìng)品ConA磁珠，都可結(jié)合E7級(jí)別數(shù)量的細(xì)胞，與競(jìng)品相當(dāng)。重復(fù)操作下，細(xì)胞捕獲率>90%。
圖7.ConA磁珠結(jié)合細(xì)胞數(shù)量和捕獲率結(jié)果圖
加速穩(wěn)定性
按1 mL/管進(jìn)行分裝。儲(chǔ)存條件分別為：4℃，37℃加速處理2天、4天、7天、11天和14天，-20℃破壞處理1天、3天、6天和8天。結(jié)果顯示同等實(shí)驗(yàn)條件下：4℃保存產(chǎn)品、37℃加速處理和-20℃破壞處理的產(chǎn)品細(xì)胞捕獲率＞95%，各處理?xiàng)l件下，3組重復(fù)CV值在1%以內(nèi)，重復(fù)性良好。
圖8. 溫度、時(shí)間加壓下的ConA磁珠細(xì)胞捕獲率結(jié)果和重復(fù)性偏差
歡迎大家根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要咨詢、選購(gòu)！
05
產(chǎn)品訂購(gòu)指南
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品編號(hào) |
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CUT&Tag組合套裝 |
Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 |
12597ES |
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InStab™ Protease Cocktail,EDTA-free,mini,tablet-form 蛋白酶抑制劑Cocktail,EDTA-free,迷你型,片劑 |
20123ES |
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Goat Anti-Mosue lgG(H+L) 山羊抗鼠IgG |
34851ES |
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Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® |
12416ES |
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CUT&Tag單品 |
pA-Tn5 Transposase (10 U/μL) |
14528ES |
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pA-Tn5 Transposase (10 U/μL, without buffer) |
14529ES |
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pG-Tn5 Transposase (10 U/μL) |
14530ES |
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Nanobody-Tn5（anti-mouse & anti-rabbit） |
12595ES |
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Anti-rabbit Tn5 |
12594ES |
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Concanavalin A-Coated Magnetic Beads |
19810ES |