漲知識 | qPCR專場一：如何做好擴增片段和引物設計？

熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種檢測方法。該方法通過在PCR體系中添加熒光基團來記錄DNA產物的累積情況，從而達到對PCR過程進行實時監控的目的，并且可以通過數據分析計算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。

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熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結果，發表高分文章，走上人生巔峰呢？

對于熒光定量PCR數據的準確性而言，反應效率至關重要。在理想狀態下，PCR反應中對應的靶標在每個循環中進行復制，每個循環增加一倍的分子量，對應的即為100%的擴增效率。隨著循環數的增加，效率的變化或差異會被放大，因此，任何造成與100%效率的偏差都可能導致數據不準確。

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擴增片段設計技巧

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不少小伙伴在進行引物設計時，對于目的擴增片段的要求沒有太多關注。然而目的片段對于做好熒光定量也十分重要。選擇較短且特異性高的目標片段是一種減少效率偏差的方法。

在給定的時間周期內擴增100個pb的靶標片段比擴增1000bp的靶標片段更能保證完全100%合成。因此，在熒光定量PCR實驗中80-200個bp能保證結果更加精準。另外較短的靶標片段受模板完整性變化的影響也相對較少,例如核酸樣本(RNA或cDNA)輕微降解且靶標片段較長，則上游引物和下游引物很難在同一DNA片段中找到其互補序列。

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靶標序列的特異性是效率偏差的另一個重要因素，靶標序列的特異性選擇可幫助引物的結合位點在基因組中是唯一的，從而降低引物在樣品基因組中其他區域擴增類似序列的可能性。

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引物設計技巧

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引物設計的好壞，密切關乎著擴增效率的高低、產物特異性的與否。所以正確設計出引物是qPCR成功的重要一步。

qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物設計要滿足一般PCR引物設計的原則，見下表。

*1 OLIGO Primer Analysis Software

*2 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

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其中qPCR引物設計需要著重關注以下幾點：

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減少引物二聚體的發生

非特異性產物本身會和SYBR 染料結合導致熒光產生，從而人為地改變反應的Ct值。非特異性擴增可以通過競爭反應組分來影響反應效率，從而導致數據準確性降低。引物二聚體是一類常見的非特異性擴增產物。引物二聚體通常是由正向和反向引物之間的相互作用引起的，但也可能是正向-正向或反向-反向引物退火的結果，或者單個引物自行折疊的結果。如果二聚化以交錯的方式發生作用，則可能發生一些片段延伸，導致產物接近預期靶標片段的大小，產生假陽性結果。

02

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區分isoform

對于同一個基因名來說，可能會有不同的isoform。isoform指的是，對于同一個基因，它的mRNA有多種不同剪接方式，這個時候表達出來的的蛋白可能會有不同，所以小伙伴們在設計實驗的時候，一定要想清楚自己要做的是哪一個isoform。

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舉個“栗子”：比如說一個基因有四種不同的isoform，如果大家想要檢測的是四種不同剪接方式轉錄本之和，那么設計引物時就要針對這四個isoform的共有序列設計。如果只想檢測其中一種isoform，那就要在這個isoform與其他三個isoform的不同序列位置設計引物。

03

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跨內含子設計引物

跨越內含子設計引物可以區分并且規避基因組DNA (gDNA)污染。gDNA可能與目的轉錄本共擴增，產生無效的數據。在熒光定量PCR實驗中避免gDNA干擾的最佳方式是嚴謹的引物設計。

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引物設計的序列最好選擇相鄰的外顯子或一端或兩端引物跨越內含子設計。當上游和下游引物在同一外顯子內發生退火時，其可擴增DNA和RNA上對應的序列。當引物在相鄰外顯子中退火時，只有cDNA會被擴增，因為此時源自gDNA的擴增片段會包括內含子序列，導致擴增子太長，無法在熒光定量PCR的反應條件下有效擴增。

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以人基因組來說，平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內含子長度小于20bp。例如外顯子長度200bp，為了兼顧擴增子長度，我們可以把上游引物設置在外顯子1和外顯子2的中間，下游引物設置在外顯子2的位置。

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以上是引物設計需要注意的問題，在初步設計好引物之后，我們需要在NCBI上進行BLAST檢驗，來確保產物的特異性。

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理論知識很豐富了，現在讓我們實戰一下吧！

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第一步

選擇靶基因

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打開NCBI，選擇“Gene”，輸入想要檢測的基因名稱，我們以人基因“ALAD”為例。

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會出現很多搜索結果，我們選擇需要的種屬來源，即“human”，如果你知道Gene ID（每個基因有且只有一個特定的ID，類似于人的身份證），也可以根據Gene ID來選擇。這里我們選擇搜索結果中的第一個。

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點開之后，會出現很長的頁面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）”欄下的NM編號，不同的NM編號，代表不同的isoform。選擇想要檢測的那一個。

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確定NM號點擊后，可以看到這個isoform的一些基本信息。

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例如：gene代表基因長度3129bp，CDS代表編碼蛋白區域149-1141bp

以及此基因的序列，如下圖所示。此序列就是設計引物時對應的模板。

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第二步

用軟件設計引物

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引物設計軟件有很多，例如oligo7、Primer5、Clone Manager等，以及很多在線網站，例如Primerbank （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）、Primer3plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi） 、NCBI 的Primer BLAST等。在手頭沒有安裝合適的軟件的時候，我們可以選擇在線網站設計引物。

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這里以延續第一步使用NCBI確定靶基因的步驟為例。了解完我們所需的isoform后，我們可以點擊右側的“Pick Primers”，就能直接進入Primer-BLAST的頁面進行引物設計了。

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在彈出來的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號。另外需要設置“上下游引物位置”和“擴增子長度”。最主要的設置就是這兩點了，另外還有“物種名稱”、“數據庫”等其他選項可以設置。

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設置好之后，點擊頁面左下角的“Get Primers”。

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彈出如下界面，點擊“Check”

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多對引物，選擇合適的引物即可。

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第三步

引物特異性驗證與確認

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以第二步中使用的Primer-BLAST為例，輸入設計好的上下游引物，其他參數不做調整改動，提交后即可看到輸入的引物是否在其他基因上也存在，若全部顯示在目標擴增的基因中，說明引物的特異性達標。

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以上是對qPCR擴增片段和引物設計的介紹，相信小伙伴們通過小翌的介紹，對如何設計擴增片段和引物已經有一定的了解啦。關于如何做好qPCR實驗，小翌會陸續在公眾號里傳授秘籍噠，敬請期待哦。

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