編者按
了解基因組的每個基因在胚胎發育過程中對個體表型的貢獻，是發育遺傳學的基本目標。單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術的成熟，使全胚胎細胞圖譜的建立成為可能。然而，這些數據大多是從野生型胚胎中收集的，并未對發育過程中存在的潛在變異進行評估。
生命發育基因能否像代碼一樣被"逆向編譯"？美國華盛頓大學發表在Nature的一項研究，在斑馬魚胚胎中首次實現全胚胎尺度、單細胞精度的反向遺傳操作，并構建了"受干擾胚胎的斑馬魚單細胞圖譜"(ZSCAPE)。
通過利用斑馬魚Crispant技術（斑馬魚Crispant技術：基因功能研究新范式）、高通量單細胞核RNA測序及Sci-Plex多重標記等技術，鑒定出33種主要組織中的99種細胞類型、156種細胞亞型，實現了對大量個體胚胎單細胞水平的全面分析，為大規模、高通量的胚胎發育及基因功能研究鋪平了道路，將加快對胚胎發育的研究，并促進對特定基因突變如何影響整個胚胎中的細胞而致病機制的理解。
01、研究概述
本研究中構建了“受干擾胚胎的斑馬魚單細胞圖譜”，收集了1812個單獨解析發育中的斑馬魚類胚胎的單細胞轉錄組數據，包括19個時間點、23個遺傳干擾和3.2 百萬個細胞。這一研究中的高度復制（每個條件下有八個或更多胚胎）使研究人員能夠評估整個生物體內細胞類型豐度的變化，并檢測細胞類型組成相對于野生型胚胎的擾動依賴性偏差。這一方法對罕見的細胞類型很敏感，可以解析腦神經節神經元的發育軌跡和遺傳依賴性，腦神經節神經元是一個占胚胎不到1%的細胞群體。
此外，對單個突變體的時間序列分析發現了一組與脊索鞘細胞具有驚人相似轉錄組的短距離獨立細胞，這導致了關于頭骨早期起源的新假設。研究人員預計，從大量個體胚胎中標準化收集高分辨率、生物體規模的單細胞數據，將有助于繪制斑馬魚細胞類型的遺傳依賴性，同時也解決發育遺傳學中的長期挑戰，包括個體表型多樣性背后的細胞和轉錄可塑性。
02、主要研究成果
1. ScEdiT單細胞編輯追蹤技術的革命性突破
本研究通過Sci-Plex多重標記技術、CRISPR-cas9基因編輯技術和單細胞轉錄組測序（sci-RNA-seq3）技術等整合，首創了ScEdiT單細胞編輯追蹤技術平臺，為大規模、高通量的胚胎發育研究鋪平了道路。
Sci-Plex多重標記技術，可以將不同樣本中的細胞或細胞核“散列”標記組合，實現細胞溯源，對多個個體同時進行分析；利用斑馬魚Crispant技術（斑馬魚Crispant技術：基因功能研究新范式）可以在胚胎早期階段（F0）產生高效突變體，實現程序化、高效的基因編輯，徹底繞開了傳統方法需要幾代才能獲得穩定突變體的漫長周期；單細胞轉錄組測序技術可以一次對數百萬個細胞核轉錄組進行分析，實現胚胎的規模檢測，并動態追蹤其變化，大大提高了實驗效率。
2. 建立ZSCAPE斑馬魚單細胞圖譜
本研究構建了ZSCAPE“受干擾胚胎的斑馬魚單細胞圖譜”，收集了1812個單獨解析發育中的斑馬魚類胚胎的單細胞轉錄組數據，包括19個時間點、23個遺傳干擾和320 萬個單細胞轉錄組。在每個時間點，研究人員收集了48—140個胚胎，在四個單細胞組合索引RNA測序（sci-RNA-seq3）實驗中，進行約17000-231000個高質量細胞的單核轉錄組。盡管在不同平臺上收集而來，但這些數據與早期斑馬魚scRNA-seq數據相一致。
總體而言，研究人員將細胞分為33種主要組織、99種廣泛的細胞類型和156種細胞亞型。
圖片圖1 斑馬魚單細胞圖
3. 基于斑馬魚crispant技術進行胚胎高分辨率的表型分析
隨后，研究人員基于斑馬魚Crispant技術、Sci-Plex標記分析了由CRISPR–Cas9突變產生的斑馬魚F0敲除物在發育過程中的細胞組成變化和單細胞遺傳擾動。通過靶向量化23個基因擾動導致的102種細胞豐度變化，如noto敲除減少脊索細胞、增加底板細胞，發現中腦神經前體細胞中，cdx4敲除導致hoxb3a/hoxc3a/hoxc6b這3個Hox基因顯著下調；最后一組的gRNA能夠在F0期敲除后產生預期表型，且不影響細胞存活。
接著，研究人員鑒定出了多種顯著差異豐度的細胞類型(DACTs)。例如，調控早期體節譜系的轉錄因子Tbx16,Msgn1,Tbx16的突變體crispants表現出一致且顯著的細胞類型豐度變化，這些轉錄因子共同調控神經中胚層祖細胞（NMPS）向中胚層祖細胞（MPCs）和脊髓后祖細胞（pSPCs）的分化。數據顯示，在這些基因突變體中，MPC和pSPC譜系均逐漸增多，揭示了這些因子對兩種譜系的協同控制作用。
圖片圖2 斑馬魚胚胎的高分辨率表型
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03、編者點評
本研究構建了“斑馬魚胚胎擾動單細胞圖譜”（ZSCAPE），并首次實現了基因擾動與全胚胎細胞表型的動態關聯，通過標準化胚胎尺度單細胞分析，將反向遺傳學推入“全胚胎+單細胞+時序”三維時代，為構建遺傳依賴全景圖譜、解析復雜表型的非編碼調控機制，從而推動精準醫療的胚胎尺度建模開辟了新路徑。
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