編者按
噬菌體在微生物組工程中展現出巨大的應用潛力，但在多成員群落和動物宿主的研究中，噬菌體的傳播動態研究仍面臨很多技術挑戰。
今天，我們分享由加州大學爾灣分校（UCI）發表在Nature Microbiology的題為“Phollow reveals in situ phage transmission dynamics in the zebrafish gut microbiome at single-virion resolution”的一項最新研究成果。該研究開發了一種熒光標記與活體成像結合技術——Phollow，并利用斑馬魚模型，首次可視化了噬菌體在斑馬魚腸道內的爆發過程。體外細胞病毒學研究表明，噬菌體顆粒在細菌裂解時分散成云狀，從而快速傳播。研究發現，斑馬魚腸道內的鄰單胞菌株(Plesiomonas)的噬菌體顆粒能快速擴散至肝臟和大腦，而大腸桿菌噬菌體則無此能力；抗生素可引發細菌間噬菌體的傳播，并導致腸道菌群失調。
Phollow技術能以單病毒顆粒分辨率原位追蹤噬菌體的復制與傳播，通過在新感染細胞內組裝噬菌體時，以不同熒光蛋白標記病毒粒子，實現細菌間噬菌體的精準傳播，為多角度研究噬菌體傳播及跨界相互作用提供了強大工具，也為基于噬菌體的微生物組療法開辟了新的路徑。
文章題目
Phollow reveals in situ phage transmission dynamics in the zebrafish gut microbiome at single-virion resolution
雜志：Nature Microbiology（IF=20.5）
發表時間：2025年4月18日
作者：Lizett Ortiz de Ora, Elizabeth T. Wiles, Dequina A. Nicholas，Travis J. Wiles等
單位：加州大學爾灣分校（UCI）等
01、研究亮點
• 開發了一種活體成像技術——Phollow，首次實現以單病毒顆粒分辨率在復雜微生物組和斑馬魚中實時追蹤噬菌體的復制與傳播，發現了不同來源的菌體行為差異及抗生素對其的影響；
• 利用斑馬魚模型構建了兩種細菌組成的群落，直接觀察斑馬魚腸道內噬菌體的動態爆發及其與宿主組織的相互作用，繪制了斑馬魚腸道內噬菌體復制的動態圖譜；
• 利用蛋白標記系統，在噬菌體衣殼上嵌入不同熒光蛋白，通過顏色變化追蹤跨細菌宿主的傳播鏈，體外追蹤細菌間噬菌體傳播，發現噬菌體在不同細胞間傳播，導致群落組成發生變化。
02、研究背景
噬菌體（Phage），又稱細菌噬菌體，是一類攻擊細菌的病毒。作為地球上數量最龐大的生物實體，噬菌體對微生物群落具有深遠影響。盡管噬菌體被視為“細菌的致命捕食者”，但它們也可以通過介導遺傳物質轉移來增強細菌的適應性。闡明噬菌體如何塑造微生物群落的結構與功能，可以為改善人類和環境健康提供新思路。例如，通過控制噬菌體爆發，可以清除致病菌或促進有益菌的傳播。然而，想要利用噬菌體清除或調控細菌群落，仍需深入理解噬菌體復制的動態機制。
裂解復制（lytic replication）是一種顯性拮抗的水平傳播方式。噬菌體侵入細菌并劫取其細胞機制以產生新病毒顆粒，最終通過宿主裂解死亡釋放子代病毒。相反，溶原復制（lysogenic replication）則是一種垂直傳播形式，常與互利共生相關，噬菌體基因組以整合或游離原噬菌體形式存在，隨宿主染色體同步復制。具備溶原能力的噬菌體稱為溫和噬菌體（temperate phages）。
噬菌體復制模式可作為調控菌群的重要靶點，然而，原位調控噬菌體復制與傳播的關鍵因素尚不明確，尤其在人類胃腸道中，許多問題尚未解答：溶原性復制爆發是局部還是全局性事件？它們是在快速還是短時間內發生的？噬菌體復制動態如何影響菌群生態及宿主的細胞與組織？由于傳統方法缺乏時空敏感性及可擴展的分辨率，這些問題很多仍有待進一步探究。若無法闡明噬菌體復制的時空特征，如噬菌體是以胞外病毒顆粒還是細胞內原噬菌體的形式存在等，則難以構建腸道內噬菌體生物學的系統性認知。
為此，研究人員開發了一套基于活體成像的原位監測噬菌體爆發的工具與技術——Phollow，突破現有技術限制，并結合斑馬魚模型，通過16組獨立實驗、超 500次成像分析及300尾斑馬魚樣本，首次實現以單病毒顆粒分辨率在復雜微生物組和斑馬魚中實時追蹤噬菌體的復制與傳播，展現了 “技術開發 - 機制解析 - 應用探索” 的研究范式，為研究微生物群落和斑馬魚腸道內的噬菌體傳播動態提供了新的解決思路。
03、斑馬魚研究結果
1. 構建Phollow用于噬菌體的感染性驗證
研究人員選擇P2類噬菌體來進行可視化噬菌體復制機制研究，并開發了一種體內標記系統，噬菌體病毒顆粒在宿主細胞內組裝時被熒光標記，但在感染新宿主細菌并復制后，會通過不同顏色的熒光標記進行示蹤。這種新的組合標記策略，命名為“Phollow”，使得追蹤噬菌體爆發期間的跨細菌傳播成為可能。
研究人員利用SpyTag/SpyCatcher標記系統構建了Phollow，對噬菌體進行熒光標記（圖1a）。對大腸桿菌HS菌株中攜帶的P2類原噬菌體DuoHS的主要衣殼蛋白（GpN）進行改造，在其C端添加肽接頭和SpyTag。隨后，通過Tn7轉座子，將與不同熒光蛋白融合的SpyCatcher組成型表達基因插入細菌染色體。在噬菌體衣殼組裝過程中，衣殼上的SpyTag與SpyCatcher蛋白共價結合，從而生成熒光標記的Phollow噬菌體（圖1a）。
在裂解復制期間，SpyCatcher蛋白從細菌胞質重新分布至正在組裝的Phollow噬菌體衣殼（圖1b）。宿主裂解后，熒光標記的Phollow噬菌體顆粒向環境擴散（圖1b）。感染不同標記的宿主后，Phollow噬菌體將攜帶新的熒光標簽，可實現跨細菌傳播的追蹤（圖1c）。Phollow噬菌體與未熒光標記的野生型噬菌體具有相似的感染性，表明其能夠精確模擬天然復制與傳播過程（圖1d）。
圖1
2. 在斑馬魚腸道內可視化觀察噬菌體的爆發
研究人員進一步將Phollow技術與斑馬魚模型結合，實現了斑馬魚腸道內微生物群落的直接觀測（圖2a）。通過將大腸桿菌Phollow病毒細胞定植于無菌斑馬魚腸道，并利用甲氧芐啶誘導裂解復制（圖2b），觀察到：給藥4h內，病毒顆粒云從食管至遠端腸道全面爆發（圖2c,d）。裂解活動呈急性特征，8h后逐漸消退，24h后幾乎無殘留。值得注意的是，未處理組雖多數無病毒顆粒，但偶見自發裂解現象（圖2c）。
甲氧芐啶誘導的腸道裂解伴隨著病毒顆粒向外部的釋放（圖2e），活體成像顯示的噬菌體爆發模式與感染性病毒顆粒數量的波動高度一致：誘導后4h，處理組溶原形成單位（LFUs）顯著高于對照組（圖2f）；24h后恢復基線。
進一步探究不同宿主來源的噬菌體是否具有類似行為，從斑馬魚腸道分離的鄰單胞菌株(Plesiomonas)中鑒定出功能性P2類原噬菌體DuoZ11。其Phollow病毒細胞展現出與大腸桿菌相似的胞內組裝與胞外擴散模式。按圖2b方案誘導后，鄰單胞菌株(Plesiomonas)噬菌體同樣在腸道內形成病毒云（圖2g）。然而，DuoZ11噬菌體顆粒被腸道內壁細胞快速內化，其中一類為通過轉基因斑馬魚確認的腸內分泌細胞（EECs）（圖2h）。
此外，鄰單胞菌株(Plesiomonas)來源的病毒顆?？裳杆購哪c道播散至肝腦等腸外器官，其在肝臟中以脂滴樣結構聚集（圖2i），在腦部血管中與血細胞表面結合（圖2j）。通過對照實驗，排除了非特異性熒光信號的干擾，證實EECs及腸外組織的信號確為病毒顆粒。與大腸桿菌噬菌體類似，鄰單胞菌株(Plesiomonas)病毒在24h后從腸道及腸外組織完全清除。
綜上，Phollow技術揭示了不同宿主來源的P2類噬菌體既存在共性特征，如快速擴散與清除等，又表現出噬菌體/菌株的獨特依賴性。
圖2
3. 斑馬魚腸道內噬菌體復制的傳播動態分析
隨后，為追蹤斑馬魚腸道內噬菌體的傳播動態，研究人員將標記的大腸桿菌Phollow病毒細胞與mKate2靶細胞組成的雙菌群定植于無菌斑馬魚腸道（圖3a）。誘導前，AausFP1病毒細胞表現出對mKate2靶細胞的定殖優勢（圖3b“未處理”），呈現強烈的空間隔離，形成克隆簇鑲嵌結構（圖3c上），與斑馬魚腸道菌群的既往觀察一致。
甲氧芐啶處理后2h檢測到AausFP1病毒細胞的裂解活動，但隨后菌群空間結構迅速重構（圖3c）；4h后，菌群出現顯著的空間混合，且該現象主要由噬菌體裂解爆發驅動，而非抗生素單獨作用。盡管此時相對豐度均未明顯改變，且mKate2靶細胞未發生溶原化（圖3b），但僅有AausFP1病毒顆粒排泄至水體（圖3d），提示細菌間傳播尚未發生。
24h后，腸道內雖無病毒殘留，但菌群空間結構近乎恢復至處理前狀態（圖3e）。群落組成分析顯示通過溶原化形成，mKate2病毒細胞出現（圖3b），表明在4-24h間發生了AausFP1噬菌體的水平傳播。二次誘導后，菌群再次出現空間解構（圖3e下），且水體中同時檢出AausFP1和mKate2噬菌體（圖3f），表明后者源自第一波裂解中形成的mKate2病毒細胞。
綜上，Phollow技術揭示了腸道菌群空間組織與噬菌體擴散/傳播間的動態耦合關系。
圖3
04、編者點評
本研究開發了一種新型遺傳工具與技術——Phollow，實現了噬菌體裂解復制與傳播的原位研究。研究表明，Phollow噬菌體可同時兼容活體成像與流式病毒測定技術，為解析噬菌體爆發的流行病學特征提供了新實驗范式。研究人員還將Phollow與斑馬魚模型結合，觀察到噬菌體在脊椎動物腸道內的爆發，為噬菌體傳播及跨界相互作用的多尺度研究提供了強大的工具，有望為基于噬菌體的微生物組療法開辟新的途徑。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！