編者按
噬菌體在微生物組工程中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，但在多成員群落和動(dòng)物宿主的研究中，噬菌體的傳播動(dòng)態(tài)研究仍面臨很多技術(shù)挑戰(zhàn)。
今天，我們分享由加州大學(xué)爾灣分校（UCI）發(fā)表在Nature Microbiology的題為“Phollow reveals in situ phage transmission dynamics in the zebrafish gut microbiome at single-virion resolution”的一項(xiàng)最新研究成果。該研究開(kāi)發(fā)了一種熒光標(biāo)記與活體成像結(jié)合技術(shù)——Phollow，并利用斑馬魚(yú)模型，首次可視化了噬菌體在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)的爆發(fā)過(guò)程。體外細(xì)胞病毒學(xué)研究表明，噬菌體顆粒在細(xì)菌裂解時(shí)分散成云狀，從而快速傳播。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)腸道內(nèi)的鄰單胞菌株(Plesiomonas)的噬菌體顆粒能快速擴(kuò)散至肝臟和大腦，而大腸桿菌噬菌體則無(wú)此能力；抗生素可引發(fā)細(xì)菌間噬菌體的傳播，并導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。
Phollow技術(shù)能以單病毒顆粒分辨率原位追蹤噬菌體的復(fù)制與傳播，通過(guò)在新感染細(xì)胞內(nèi)組裝噬菌體時(shí)，以不同熒光蛋白標(biāo)記病毒粒子，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌間噬菌體的精準(zhǔn)傳播，為多角度研究噬菌體傳播及跨界相互作用提供了強(qiáng)大工具，也為基于噬菌體的微生物組療法開(kāi)辟了新的路徑。
文章題目
Phollow reveals in situ phage transmission dynamics in the zebrafish gut microbiome at single-virion resolution
雜志：Nature Microbiology（IF=20.5）
發(fā)表時(shí)間：2025年4月18日
作者：Lizett Ortiz de Ora, Elizabeth T. Wiles, Dequina A. Nicholas，Travis J. Wiles等
單位：加州大學(xué)爾灣分校（UCI）等
01、研究亮點(diǎn)
• 開(kāi)發(fā)了一種活體成像技術(shù)——Phollow，首次實(shí)現(xiàn)以單病毒顆粒分辨率在復(fù)雜微生物組和斑馬魚(yú)中實(shí)時(shí)追蹤噬菌體的復(fù)制與傳播，發(fā)現(xiàn)了不同來(lái)源的菌體行為差異及抗生素對(duì)其的影響；
• 利用斑馬魚(yú)模型構(gòu)建了兩種細(xì)菌組成的群落，直接觀(guān)察斑馬魚(yú)腸道內(nèi)噬菌體的動(dòng)態(tài)爆發(fā)及其與宿主組織的相互作用，繪制了斑馬魚(yú)腸道內(nèi)噬菌體復(fù)制的動(dòng)態(tài)圖譜；
• 利用蛋白標(biāo)記系統(tǒng)，在噬菌體衣殼上嵌入不同熒光蛋白，通過(guò)顏色變化追蹤跨細(xì)菌宿主的傳播鏈，體外追蹤細(xì)菌間噬菌體傳播，發(fā)現(xiàn)噬菌體在不同細(xì)胞間傳播，導(dǎo)致群落組成發(fā)生變化。
02、研究背景
噬菌體（Phage），又稱(chēng)細(xì)菌噬菌體，是一類(lèi)攻擊細(xì)菌的病毒。作為地球上數(shù)量最龐大的生物實(shí)體，噬菌體對(duì)微生物群落具有深遠(yuǎn)影響。盡管噬菌體被視為“細(xì)菌的致命捕食者”，但它們也可以通過(guò)介導(dǎo)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移來(lái)增強(qiáng)細(xì)菌的適應(yīng)性。闡明噬菌體如何塑造微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能，可以為改善人類(lèi)和環(huán)境健康提供新思路。例如，通過(guò)控制噬菌體爆發(fā)，可以清除致病菌或促進(jìn)有益菌的傳播。然而，想要利用噬菌體清除或調(diào)控細(xì)菌群落，仍需深入理解噬菌體復(fù)制的動(dòng)態(tài)機(jī)制。
裂解復(fù)制（lytic replication）是一種顯性拮抗的水平傳播方式。噬菌體侵入細(xì)菌并劫取其細(xì)胞機(jī)制以產(chǎn)生新病毒顆粒，最終通過(guò)宿主裂解死亡釋放子代病毒。相反，溶原復(fù)制（lysogenic replication）則是一種垂直傳播形式，常與互利共生相關(guān)，噬菌體基因組以整合或游離原噬菌體形式存在，隨宿主染色體同步復(fù)制。具備溶原能力的噬菌體稱(chēng)為溫和噬菌體（temperate phages）。
噬菌體復(fù)制模式可作為調(diào)控菌群的重要靶點(diǎn)，然而，原位調(diào)控噬菌體復(fù)制與傳播的關(guān)鍵因素尚不明確，尤其在人類(lèi)胃腸道中，許多問(wèn)題尚未解答：溶原性復(fù)制爆發(fā)是局部還是全局性事件？它們是在快速還是短時(shí)間內(nèi)發(fā)生的？噬菌體復(fù)制動(dòng)態(tài)如何影響菌群生態(tài)及宿主的細(xì)胞與組織？由于傳統(tǒng)方法缺乏時(shí)空敏感性及可擴(kuò)展的分辨率，這些問(wèn)題很多仍有待進(jìn)一步探究。若無(wú)法闡明噬菌體復(fù)制的時(shí)空特征，如噬菌體是以胞外病毒顆粒還是細(xì)胞內(nèi)原噬菌體的形式存在等，則難以構(gòu)建腸道內(nèi)噬菌體生物學(xué)的系統(tǒng)性認(rèn)知。
為此，研究人員開(kāi)發(fā)了一套基于活體成像的原位監(jiān)測(cè)噬菌體爆發(fā)的工具與技術(shù)——Phollow，突破現(xiàn)有技術(shù)限制，并結(jié)合斑馬魚(yú)模型，通過(guò)16組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)、超 500次成像分析及300尾斑馬魚(yú)樣本，首次實(shí)現(xiàn)以單病毒顆粒分辨率在復(fù)雜微生物組和斑馬魚(yú)中實(shí)時(shí)追蹤噬菌體的復(fù)制與傳播，展現(xiàn)了 “技術(shù)開(kāi)發(fā) - 機(jī)制解析 - 應(yīng)用探索” 的研究范式，為研究微生物群落和斑馬魚(yú)腸道內(nèi)的噬菌體傳播動(dòng)態(tài)提供了新的解決思路。
03、斑馬魚(yú)研究結(jié)果
1. 構(gòu)建Phollow用于噬菌體的感染性驗(yàn)證
研究人員選擇P2類(lèi)噬菌體來(lái)進(jìn)行可視化噬菌體復(fù)制機(jī)制研究，并開(kāi)發(fā)了一種體內(nèi)標(biāo)記系統(tǒng)，噬菌體病毒顆粒在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝時(shí)被熒光標(biāo)記，但在感染新宿主細(xì)菌并復(fù)制后，會(huì)通過(guò)不同顏色的熒光標(biāo)記進(jìn)行示蹤。這種新的組合標(biāo)記策略，命名為“Phollow”，使得追蹤噬菌體爆發(fā)期間的跨細(xì)菌傳播成為可能。
研究人員利用SpyTag/SpyCatcher標(biāo)記系統(tǒng)構(gòu)建了Phollow，對(duì)噬菌體進(jìn)行熒光標(biāo)記（圖1a）。對(duì)大腸桿菌HS菌株中攜帶的P2類(lèi)原噬菌體DuoHS的主要衣殼蛋白（GpN）進(jìn)行改造，在其C端添加肽接頭和SpyTag。隨后，通過(guò)Tn7轉(zhuǎn)座子，將與不同熒光蛋白融合的SpyCatcher組成型表達(dá)基因插入細(xì)菌染色體。在噬菌體衣殼組裝過(guò)程中，衣殼上的SpyTag與SpyCatcher蛋白共價(jià)結(jié)合，從而生成熒光標(biāo)記的Phollow噬菌體（圖1a）。
在裂解復(fù)制期間，SpyCatcher蛋白從細(xì)菌胞質(zhì)重新分布至正在組裝的Phollow噬菌體衣殼（圖1b）。宿主裂解后，熒光標(biāo)記的Phollow噬菌體顆粒向環(huán)境擴(kuò)散（圖1b）。感染不同標(biāo)記的宿主后，Phollow噬菌體將攜帶新的熒光標(biāo)簽，可實(shí)現(xiàn)跨細(xì)菌傳播的追蹤（圖1c）。Phollow噬菌體與未熒光標(biāo)記的野生型噬菌體具有相似的感染性，表明其能夠精確模擬天然復(fù)制與傳播過(guò)程（圖1d）。
圖1
2. 在斑馬魚(yú)腸道內(nèi)可視化觀(guān)察噬菌體的爆發(fā)
研究人員進(jìn)一步將Phollow技術(shù)與斑馬魚(yú)模型結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了斑馬魚(yú)腸道內(nèi)微生物群落的直接觀(guān)測(cè)（圖2a）。通過(guò)將大腸桿菌Phollow病毒細(xì)胞定植于無(wú)菌斑馬魚(yú)腸道，并利用甲氧芐啶誘導(dǎo)裂解復(fù)制（圖2b），觀(guān)察到：給藥4h內(nèi)，病毒顆粒云從食管至遠(yuǎn)端腸道全面爆發(fā)（圖2c,d）。裂解活動(dòng)呈急性特征，8h后逐漸消退，24h后幾乎無(wú)殘留。值得注意的是，未處理組雖多數(shù)無(wú)病毒顆粒，但偶見(jiàn)自發(fā)裂解現(xiàn)象（圖2c）。
甲氧芐啶誘導(dǎo)的腸道裂解伴隨著病毒顆粒向外部的釋放（圖2e），活體成像顯示的噬菌體爆發(fā)模式與感染性病毒顆粒數(shù)量的波動(dòng)高度一致：誘導(dǎo)后4h，處理組溶原形成單位（LFUs）顯著高于對(duì)照組（圖2f）；24h后恢復(fù)基線(xiàn)。
進(jìn)一步探究不同宿主來(lái)源的噬菌體是否具有類(lèi)似行為，從斑馬魚(yú)腸道分離的鄰單胞菌株(Plesiomonas)中鑒定出功能性P2類(lèi)原噬菌體DuoZ11。其Phollow病毒細(xì)胞展現(xiàn)出與大腸桿菌相似的胞內(nèi)組裝與胞外擴(kuò)散模式。按圖2b方案誘導(dǎo)后，鄰單胞菌株(Plesiomonas)噬菌體同樣在腸道內(nèi)形成病毒云（圖2g）。然而，DuoZ11噬菌體顆粒被腸道內(nèi)壁細(xì)胞快速內(nèi)化，其中一類(lèi)為通過(guò)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)確認(rèn)的腸內(nèi)分泌細(xì)胞（EECs）（圖2h）。
此外，鄰單胞菌株(Plesiomonas)來(lái)源的病毒顆粒可迅速?gòu)哪c道播散至肝腦等腸外器官，其在肝臟中以脂滴樣結(jié)構(gòu)聚集（圖2i），在腦部血管中與血細(xì)胞表面結(jié)合（圖2j）。通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，排除了非特異性熒光信號(hào)的干擾，證實(shí)EECs及腸外組織的信號(hào)確為病毒顆粒。與大腸桿菌噬菌體類(lèi)似，鄰單胞菌株(Plesiomonas)病毒在24h后從腸道及腸外組織完全清除。
綜上，Phollow技術(shù)揭示了不同宿主來(lái)源的P2類(lèi)噬菌體既存在共性特征，如快速擴(kuò)散與清除等，又表現(xiàn)出噬菌體/菌株的獨(dú)特依賴(lài)性。
圖2
3. 斑馬魚(yú)腸道內(nèi)噬菌體復(fù)制的傳播動(dòng)態(tài)分析
隨后，為追蹤斑馬魚(yú)腸道內(nèi)噬菌體的傳播動(dòng)態(tài)，研究人員將標(biāo)記的大腸桿菌Phollow病毒細(xì)胞與mKate2靶細(xì)胞組成的雙菌群定植于無(wú)菌斑馬魚(yú)腸道（圖3a）。誘導(dǎo)前，AausFP1病毒細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)mKate2靶細(xì)胞的定殖優(yōu)勢(shì)（圖3b“未處理”），呈現(xiàn)強(qiáng)烈的空間隔離，形成克隆簇鑲嵌結(jié)構(gòu)（圖3c上），與斑馬魚(yú)腸道菌群的既往觀(guān)察一致。
甲氧芐啶處理后2h檢測(cè)到AausFP1病毒細(xì)胞的裂解活動(dòng)，但隨后菌群空間結(jié)構(gòu)迅速重構(gòu)（圖3c）；4h后，菌群出現(xiàn)顯著的空間混合，且該現(xiàn)象主要由噬菌體裂解爆發(fā)驅(qū)動(dòng)，而非抗生素單獨(dú)作用。盡管此時(shí)相對(duì)豐度均未明顯改變，且mKate2靶細(xì)胞未發(fā)生溶原化（圖3b），但僅有AausFP1病毒顆粒排泄至水體（圖3d），提示細(xì)菌間傳播尚未發(fā)生。
24h后，腸道內(nèi)雖無(wú)病毒殘留，但菌群空間結(jié)構(gòu)近乎恢復(fù)至處理前狀態(tài)（圖3e）。群落組成分析顯示通過(guò)溶原化形成，mKate2病毒細(xì)胞出現(xiàn)（圖3b），表明在4-24h間發(fā)生了AausFP1噬菌體的水平傳播。二次誘導(dǎo)后，菌群再次出現(xiàn)空間解構(gòu)（圖3e下），且水體中同時(shí)檢出AausFP1和mKate2噬菌體（圖3f），表明后者源自第一波裂解中形成的mKate2病毒細(xì)胞。
綜上，Phollow技術(shù)揭示了腸道菌群空間組織與噬菌體擴(kuò)散/傳播間的動(dòng)態(tài)耦合關(guān)系。
圖3
04、編者點(diǎn)評(píng)
本研究開(kāi)發(fā)了一種新型遺傳工具與技術(shù)——Phollow，實(shí)現(xiàn)了噬菌體裂解復(fù)制與傳播的原位研究。研究表明，Phollow噬菌體可同時(shí)兼容活體成像與流式病毒測(cè)定技術(shù)，為解析噬菌體爆發(fā)的流行病學(xué)特征提供了新實(shí)驗(yàn)范式。研究人員還將Phollow與斑馬魚(yú)模型結(jié)合，觀(guān)察到噬菌體在脊椎動(dòng)物腸道內(nèi)的爆發(fā)，為噬菌體傳播及跨界相互作用的多尺度研究提供了強(qiáng)大的工具，有望為基于噬菌體的微生物組療法開(kāi)辟新的途徑。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開(kāi)拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚(yú)生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚(yú)、類(lèi)器官、哺乳動(dòng)物、人體”多維生物技術(shù)服務(wù)體系，開(kāi)展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚(yú)模型，胃癌、腦類(lèi)器官、心臟類(lèi)器官及各種腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢(xún)！