題目：Proteomic analysis by iTRAQ-PRM provides integrated insight into mechanisms of resistance in pepper to Bemisia tabaci
期刊：BMC PLANT BIOLOGY
研究背景
煙粉虱是辣椒的主要食葉害蟲，對辣椒的生長和產量造成嚴重損害。因此，研究辣椒對煙粉虱的抗性機理，育種和推廣辣椒對煙粉虱的抗性品種尤為重要。然而，關于植物如何感知和防御害蟲的分子機制非常有限。蛋白質組技術為研究植物對抗煙粉虱的生理反應所涉及的分子機制提供了一些見解。
技術路線
圖1
研究人員先通過篩選，挑選出了對煙粉虱高抗性和敏感性的植株；后將兩種植株在煙粉虱環境下培養了48h，發現兩種植株存在不同的表型差異；接著，研究人員利用蛋白質組學技術，找到了差異表型下的差異蛋白；然后通過生物信息學分析，分析了這些差異蛋白的生物學功能；最后，研究人員利用RT-PCR和基于質譜的PRM技術對差異蛋白進行了驗證。根據上述結果，分析討論了辣椒對煙粉虱的抗性的機理。
實驗結果
1、 煙粉虱處理后的表型變化
在初步實驗中，作者篩選了許多辣椒材料，并鑒定出兩個辣椒基因型變種，它們顯示出對煙粉虱的高抗性（RG）或敏感性（SG）。對兩種基因型的抗性進行研究，發現高抗性(RG)的辣椒葉片呈深綠色，而敏感型(SG)的辣椒葉片呈淺綠色。兩個品種間成年煙粉虱的沉降行為不同。煙粉虱在SG上的種群數量是在RG上的40倍左右。同樣，SG的卵孵化率較高，而RG的卵孵化率較低(圖2c)。因此，這兩種基因型是研究辣椒對煙粉虱侵染的蛋白質組學機制的理想選擇。
圖2
2、 iTRAQ定量蛋白質組學分析
作者利用itraq定量蛋白質組學技術比較了正常組(RC)、高抗組（RG）、敏感組（SG）辣椒葉片在感染煙粉虱前后的蛋白差異表達情況，共鑒定了20,102個肽和2756個蛋白（至少兩個高置信度的特征性）。比較組RC-SC、RB-RC、SB-SC差異蛋白韋恩分析結果如下圖所示：在3個比較組中總共統計到了115種蛋白發生差異變化，其中有24種差異蛋白是高抗性品種中所特有的。
圖3
在找到這些差異蛋白之后，作者進一步對差異蛋白進行了功能分析。發現這些差異蛋白主要參與代謝過程，細胞過程，對刺激的反應等生物學過程。結合差異蛋白的上下調關系，作者認為細胞壁蛋白在內的相關蛋白提高了辣椒對煙粉虱病的耐受性，此外光合作用相關蛋白在辣椒對煙粉虱的抗性中也起重要作用。
圖4
為了進一步理清這些相關蛋白的上下游聯系，作者分析了這些蛋白所參與的信號通路。通過KEGG通路聚類分析，作者發現這些差異蛋白多聚類在碳固定、亞麻酸代謝、光合作用等相關信號通路。根據GO功能和KEGG途徑分析，作者認為參與刺激反應，抗氧化劑防御，光合作用和亞油酸代謝的多種蛋白質可能對煙粉虱的損害具有防御作用。
實驗驗證
基于質譜的分析結果，作者在基因水平上采用了RT-PCR技術去驗證差異蛋白的表達情況。在挑選的6個基因中，其中有4個基因的表達水平與蛋白變化一致，還有兩個存在差異，這種差異可能歸因于mRNA穩定性，內源性剪接，翻譯調控，翻譯后加工，蛋白質更新控制，蛋白質降解等等因素影響所致。
圖5
作者近一步挑選了與抗性相關的10個蛋白進行了PRM驗證，其中，有8種具有MS /MS光譜和獨特的肽，能夠在質譜中被驗證。通過PRM驗證，作者發現其變化趨勢與iTRAQ結果基本一致，驗證了iTRAQ結果的可靠性。
圖6
實驗小結
本文通過iTRAQ定量蛋白質組學方法，尋找了高抗性、敏感性及正常辣椒植株間，在煙粉虱侵染后的差異蛋白表達變化，找到了與抗性相關的一些關鍵蛋白和信號通路。然后借助PRM等技術手段，驗證了組學結果的可靠性。結合實驗結果和已有文獻報道，提出了提高光合作用能增添植株煙粉虱抗性，植物防御代謝物的合成需要固定碳或增加光合活性，以彌補昆蟲對葉面積的損失的觀點。闡述了煙粉虱侵染辣椒后的防御反應機制，為辣椒煙粉虱病蟲害的防治和辣椒的育種提供的新的方向。
相/關/服/務
iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）是一種體外同重同位素標記的相對與絕對定量技術，利用多種同位素試劑標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團，經高精度質譜儀串聯分析，可同時比較多達8種樣品之間的蛋白表達量，是近年來定量蛋白質組學中應用最廣泛的高通量篩選技術。
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