題目：Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle
泛素化修飾組學研究晝夜節(jié)律調控機制
期刊：Cell Reports
影響因子：8.032
主要技術：泛素化修飾組學
研究背景
晝夜節(jié)律機制幫助生物個體調整其生理功能以適應外界環(huán)境的變化。早期的機制研究多集中在轉錄調控機制基礎之上，隨著研究的深入，蛋白水平調控，特別是各種翻譯后修飾，如泛素化，對晝夜節(jié)律的調控同樣起到了重要作用。
研究結果
1. 泛素化蛋白質組學鑒定晝夜節(jié)律相關蛋白
作者利用基于泛素化修飾蛋白質組學的方法，對處于不同時間節(jié)點的果蠅頭部樣本進行泛素化label free質譜檢測分析，每組樣本包含三個生物學重復。果蠅頭部提取物中的時鐘蛋白質主要來源于視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜具有自己的時鐘基因，而恒定黑暗中的運動活動節(jié)律很大程度上取決于腦時鐘網(wǎng)絡的小側腹神經(jīng)元（sLNv）振蕩器。因此，作者將tim + clock細胞的泛素化組學數(shù)據(jù)與胚胎神經(jīng)細胞和成人光感受器的兩個泛素化組學數(shù)據(jù)集進行了比較，發(fā)現(xiàn)在光感受器和時鐘細胞中同時存在91種泛素化蛋白（圖 1D）。在不同的時間節(jié)點之間的泛素化修飾的差異蛋白有52個（圖1E），在這些差異蛋白中，一個核孔復合物蛋白MTOR的豐度變化隨著時間的變化尤其顯著（圖1F）。一般情況下泛素化蛋白豐度的倍數(shù)變化集中在2倍以下（圖 1G），這與哺乳動物肝臟中總蛋白水平的晝夜節(jié)律相似。作者對52個候選蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白質不均勻相分布，大多數(shù)在CT6達到峰值（n = 43）。因此，作者認為，時鐘細胞中的蛋白質泛素化集中在白天，而晝夜節(jié)律控制的蛋白質合成主要集中于CT7（中午）和CT19（午夜），以雙峰方式呈現(xiàn)。
圖1 泛素化蛋白質組學鑒定晝夜節(jié)律相關蛋白
2. MTOR蛋白節(jié)律泛素化
為了驗證組學結果，作者選擇了幾個候選蛋白進行WB驗證實驗。結果表明，有四個候選蛋白（HSP83，NRV2，MTOR和SGG）顯示出可識別的泛素化，但是只有純化的bioUb樣品的MTOR免疫印跡結果表現(xiàn)出泛素化節(jié)律性（圖 2A和2B）。為了控制總蛋白水平的可能節(jié)律性，作者選擇抗MTOR印跡果蠅頭部裂解物，發(fā)現(xiàn)蛋白質水平?jīng)]有明顯變化（圖 2C），這表明MTOR的泛素化程度是受到調控的。MTOR是與NUP153形成核籃的最內核孔蛋白，它參與細胞分裂的控制并在染色質調節(jié)中發(fā)揮作用。
為了研究這種調控對節(jié)律的影響，作者利用RNAi的技術敲除MTOR，發(fā)現(xiàn)敲除導致行為周期延長并降低節(jié)律性的幅度（圖2D）。
圖2 MTOR的節(jié)奏泛素化
3. MTOR的泛素化影響晝夜節(jié)律的分子機制
MTOR作為核孔蛋白促使作者研究了Mtor RNAi蠅的sLNv中PER、TIM的亞細胞定位和在不同時間節(jié)點的蛋白水平，來探究其影響晝夜節(jié)律的分子機制。PER和TIM通常從CT18開始經(jīng)歷由精細調節(jié)的細胞質到核的轉變，以實現(xiàn)它們作為轉錄抑制因子的作用。與野生型相比，TIM和PER在Mtor RNAi sLNvs的兩個時間點顯示出更多的細胞質定位（圖3），表明這些蛋白質的核定位缺陷可能導致行為期延長。午夜時分，TIM和PER的表達水平有非常顯著的提升，早上TIM和PER的降解速度也變慢。綜上表明，MTOR通過影響下游TIM及PER蛋白的定位及泛素化水平，進而控制果蠅節(jié)律。
圖3 PER和TIM亞細胞定位
圖4 MTOR的泛素化影響晝夜節(jié)律的分子機制
研究小結
作者認為，除控制節(jié)律性蛋白質降解外，晝夜節(jié)律調節(jié)的泛素化可能會引導蛋白質功能的震蕩變化，如果蠅中核孔復合體蛋白MTOR受到周期性泛素化的調控，影響其蛋白表達量，并且在晝夜節(jié)律分子振蕩器的反饋系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。
解析文獻
áron Szabó, Christian Papin,et al. Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle. Cell Reports, 2018 , 23 (8) :2273-2282.
參考文獻
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