題目：Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle
泛素化修飾組學研究晝夜節律調控機制
期刊：Cell Reports
影響因子：8.032
主要技術：泛素化修飾組學
研究背景
晝夜節律機制幫助生物個體調整其生理功能以適應外界環境的變化。早期的機制研究多集中在轉錄調控機制基礎之上，隨著研究的深入，蛋白水平調控，特別是各種翻譯后修飾，如泛素化，對晝夜節律的調控同樣起到了重要作用。
研究結果
1. 泛素化蛋白質組學鑒定晝夜節律相關蛋白
作者利用基于泛素化修飾蛋白質組學的方法，對處于不同時間節點的果蠅頭部樣本進行泛素化label free質譜檢測分析，每組樣本包含三個生物學重復。果蠅頭部提取物中的時鐘蛋白質主要來源于視網膜，視網膜具有自己的時鐘基因，而恒定黑暗中的運動活動節律很大程度上取決于腦時鐘網絡的小側腹神經元（sLNv）振蕩器。因此，作者將tim + clock細胞的泛素化組學數據與胚胎神經細胞和成人光感受器的兩個泛素化組學數據集進行了比較，發現在光感受器和時鐘細胞中同時存在91種泛素化蛋白（圖 1D）。在不同的時間節點之間的泛素化修飾的差異蛋白有52個（圖1E），在這些差異蛋白中，一個核孔復合物蛋白MTOR的豐度變化隨著時間的變化尤其顯著（圖1F）。一般情況下泛素化蛋白豐度的倍數變化集中在2倍以下（圖 1G），這與哺乳動物肝臟中總蛋白水平的晝夜節律相似。作者對52個候選蛋白進行分析，發現泛素化蛋白質不均勻相分布，大多數在CT6達到峰值（n = 43）。因此，作者認為，時鐘細胞中的蛋白質泛素化集中在白天，而晝夜節律控制的蛋白質合成主要集中于CT7（中午）和CT19（午夜），以雙峰方式呈現。
圖1 泛素化蛋白質組學鑒定晝夜節律相關蛋白
2. MTOR蛋白節律泛素化
為了驗證組學結果，作者選擇了幾個候選蛋白進行WB驗證實驗。結果表明，有四個候選蛋白（HSP83，NRV2，MTOR和SGG）顯示出可識別的泛素化，但是只有純化的bioUb樣品的MTOR免疫印跡結果表現出泛素化節律性（圖 2A和2B）。為了控制總蛋白水平的可能節律性，作者選擇抗MTOR印跡果蠅頭部裂解物，發現蛋白質水平沒有明顯變化（圖 2C），這表明MTOR的泛素化程度是受到調控的。MTOR是與NUP153形成核籃的最內核孔蛋白，它參與細胞分裂的控制并在染色質調節中發揮作用。
為了研究這種調控對節律的影響，作者利用RNAi的技術敲除MTOR，發現敲除導致行為周期延長并降低節律性的幅度（圖2D）。
圖2 MTOR的節奏泛素化
3. MTOR的泛素化影響晝夜節律的分子機制
MTOR作為核孔蛋白促使作者研究了Mtor RNAi蠅的sLNv中PER、TIM的亞細胞定位和在不同時間節點的蛋白水平，來探究其影響晝夜節律的分子機制。PER和TIM通常從CT18開始經歷由精細調節的細胞質到核的轉變，以實現它們作為轉錄抑制因子的作用。與野生型相比，TIM和PER在Mtor RNAi sLNvs的兩個時間點顯示出更多的細胞質定位（圖3），表明這些蛋白質的核定位缺陷可能導致行為期延長。午夜時分，TIM和PER的表達水平有非常顯著的提升，早上TIM和PER的降解速度也變慢。綜上表明，MTOR通過影響下游TIM及PER蛋白的定位及泛素化水平，進而控制果蠅節律。
圖3 PER和TIM亞細胞定位
圖4 MTOR的泛素化影響晝夜節律的分子機制
研究小結
作者認為，除控制節律性蛋白質降解外，晝夜節律調節的泛素化可能會引導蛋白質功能的震蕩變化，如果蠅中核孔復合體蛋白MTOR受到周期性泛素化的調控，影響其蛋白表達量，并且在晝夜節律分子振蕩器的反饋系統中發揮重要作用。
解析文獻
áron Szabó, Christian Papin,et al. Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle. Cell Reports, 2018 , 23 (8) :2273-2282.
參考文獻
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