熒光蛋白是分子生物實驗中最常用的工具，通常用來檢測細胞的各種生物學過程。那么，選擇哪種熒光蛋白才能做出完美的實驗結果？要解決這個問題，就需要我們了解常用熒光蛋白的特性、用途，對癥下藥，選擇合適的熒光蛋白。
一、熒光蛋白的特性
最早在1962年，Shimomura等從維多利亞多管水母中分離出了第一個綠色熒光蛋白GFP，含有約238個氨基酸，27KDa，其中第65-67位(Ser-Tyr-Gly)通過自身環化和氧化形成發色基團。另外，GFP不需要與任何底物作用，僅在長紫外光或藍光下就能發出綠光。
GFP結構及光譜圖
但是由于GFP熒光不夠強，最大激發光又接近紫外范圍，可能會損壞活細胞，后來科學家們通過突變GFP得到了增強型的綠色熒光蛋白EGFP和很多突變體，包括對pH敏感的綠色熒光pHluorin、對酸性敏感的黃色熒光EYFP及藍色熒光EBFP和青色熒光ECFP等，這些熒光蛋白的出現對于實現同一細胞內的多種熒光標記提供了有力幫助。
常見熒光的光譜圖
除了多管水母，在珊瑚蟲中也有綠色熒光蛋白ZsGreen，它的亮度高于EGFP。由于突變GFP得不到紅色熒光，科學家先是從Discosoma striata珊瑚中分離出了DsRed蛋白，但是它成熟緩慢，有毒，且和綠色光譜重疊，因此不適合作為報告基因。后來，經過一系列改造得到了很多紅色熒光蛋白，如光強高于DsRed的DsRed2蛋白。下圖提供了常見熒光蛋白的激發波長和發射波長，可以根據實驗目的選擇合適的熒光蛋白，同時也要看下實驗室的顯微鏡是否滿足蛋白的發光條件。
常見熒光蛋白特性
二、熒光蛋白的應用
熒光蛋白是一種可視化的編碼蛋白，它不需要任何底物輔助，只需要在特定波長下就能發光，而且易于檢測，因此被廣泛應用于動、植物細胞及真菌內的分子生物學研究。
(1)目的基因可以與熒光蛋白融合、轉染細胞，通過觀察熒光研究基因的亞細胞定位和表達變化；同時也可以將目的蛋白根據結構域進行截短分別融合熒光，通過觀察細胞內熒光的定位差異，推測目的基因的定位信號大致在哪個區域。
EGFP融合全長/缺失部分結構域SDCT1蛋白的亞細胞定位
(2)將目的基因的啟動子和熒光蛋白重組構建，把熒光當作下游報告基因，通過觀察熒光強弱檢測細胞的狀態及啟動子在不同狀態下表達基因的能力。
通過兔Oct4啟動子-EGFP報告系統監測細胞分化狀態
(3)可以利用熒光蛋白監控活體生物體內的細胞活動和基因行為。如近紅外熒光蛋白(iRFP713)在動物組織中穿透力強，而且它的光吸收和光散射量較低，因此常用于動物活體成像實驗中。
iRFP713在Hela/MCF-7細胞和小鼠骨骼肌內的熒光成像
(4)熒光蛋白可以作為生物感受器，通過檢測熒光強弱變化監測細胞的狀態。如鈣離子成像技術，鈣離子指示劑GCaMP由EGFP和鈣調蛋白、鈣調蛋白結合肽M13組成，本身不發光，但當神經元發生去極化時，鈣離子內流作用于鈣調素-M13，引起EGFP空間結構變化產生綠光，所以通過觀察綠光指示鈣離子濃度的變化以及明確哪些神經元在放電。
鈣離子指示劑GCaMP發光原理(Grienberger & Konnerth. 2012)
(5)可以采用GFP-LC3單熒光/mRFP-GFP-LC3雙熒光體系示蹤自噬的形成。LC3在自噬形成中發生聚集，無自噬形成時，GFP-LC3蛋白彌散在胞漿中；當自噬形成時，GFP-LC3蛋白轉位至自噬體膜上，熒光顯微鏡下會形成多個明亮的綠光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，通過計數可以評價自噬活性的高低。
而mRFP-GFP-LC3雙熒光體系可用于標記、追蹤LC3及自噬流的變化。當自噬小體融合溶酶體形成自噬溶酶體時，PH下降，GFP對酸性敏感發生淬滅，而mRFP不受外界影響。因此，可以通過觀察綠光的強弱來指示自噬溶酶體形成的順利程度，通過GFP與mRFP的亮點比例來評價自噬流的進程。
敲低Atg5/Atg7逆轉了嗎非處理PC12細胞引起的自噬增加
三、熒光蛋白的選擇
除了參考熒光蛋白的特性和用途外，以下幾點也要作為選擇熒光蛋白的標準。
(1)盡量選擇單體結構的熒光蛋白與基因融合，減少對目的基因定位的影響。如四聚體結構的ZsGreen和DsRed都不適合與目的基因融合。
(2)對于短壽命的目的蛋白，要選擇成熟較快的熒光蛋白進行融合。
(3)現在實驗室所用的熒光蛋白都經過了密碼子優化，可以在哺乳細胞內高表達，所以當目的細胞的種屬比較少見時，建議選擇密碼子優化過的熒光蛋白進行構建。
(4)同一細胞株內不能選用相互干擾的熒光蛋白。
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