研究材料
AOM-DSS模型鼠、AOM-DSS+Hhep小鼠
技術(shù)路線
· 步驟1：表型數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)Hhep定殖介導(dǎo)了結(jié)腸癌中強(qiáng)大的抗腫瘤作用；
· 步驟2：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示Hhep定殖增加細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤并促使TLSs的擴(kuò)張；
· 步驟3：Tfh 細(xì)胞是 Hhep 介導(dǎo)的腫瘤控制和免疫浸潤所必需的。
研究結(jié)果
1. Hhep定殖重塑結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境
前人的研究表明，Hhep菌（一種具有內(nèi)在免疫原性的腸道細(xì)菌）定殖荷瘤小鼠引發(fā)的特異性免疫反應(yīng)可修飾結(jié)腸癌微生物群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗腫瘤免疫增強(qiáng)。本研究，作者將Hhep菌定殖于生長7周的結(jié)直腸癌（CRC）小鼠模型中，相對于對照組（荷瘤小鼠無Hhep菌定殖），Hhep定殖顯著減少了腫瘤的數(shù)量和大小，延長了小鼠的生存周期。同時，Hhep定殖對腫瘤小鼠的腸道微生物群產(chǎn)生影響，以及腫瘤的免疫細(xì)胞浸潤增加。以上結(jié)果表明，Hhep定殖介導(dǎo)了結(jié)腸癌中強(qiáng)大的抗腫瘤作用。
圖1 Hhep可降低腫瘤負(fù)荷并增加CRC的生存周期
2. Hhep驅(qū)動的抗腫瘤免疫
為了更全面的了解Hhep定殖對CRC TME的影響，作者對腫瘤上皮層細(xì)胞（epithelial layer,EL）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定出12個細(xì)胞簇，Hhep定殖誘導(dǎo)了細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（簇1）和效應(yīng)T細(xì)胞（簇5）的增加。其中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞包含多種不同的NK細(xì)胞和T細(xì)胞（CD8+、CD4+），表達(dá)與細(xì)胞毒性功能相關(guān)的基因（Gzma）。以上數(shù)據(jù)表明，Hhep定殖增加細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤。
圖2 Hhep定殖導(dǎo)致腫瘤TME的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的增加
3. Hhep定殖促使TLSs擴(kuò)張
前人的研究表明，Hhep特異性CD4+T細(xì)胞主要在結(jié)腸固有層（ lamina propria,LP）中積累（Chai et al., 2017; Xu et al., 2018），因此作者利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析了Hhep定殖對LP的影響。聚類分析揭示了表達(dá)與基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的細(xì)胞（簇 1、5、9 和 13）的富集，特別是 Hhep 定殖小鼠中 Ccl21a+Lyve1+ 淋巴管簇（簇 9、子簇 2）的增加。同時，作者觀察到 LP 中淋巴管生成所需基因（Pdpn，Vegfc）的頻率增加，熒光顯微鏡顯示 Lyve-1 染色增加。Hhep定殖的小鼠顯示腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)部的TLSs數(shù)量增加，與TLS形成相關(guān)的基因表達(dá)增加，以上數(shù)據(jù)表明，Hhep 定殖促使小鼠結(jié)腸淋巴網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)張。
圖3 Hhep定殖擴(kuò)大了結(jié)腸淋巴網(wǎng)絡(luò)
4. Hhep定殖驅(qū)動Hhep特異性CD4+Tfh細(xì)胞擴(kuò)增
抗體介導(dǎo)的耗竭實(shí)驗(yàn)顯示，抗腫瘤免疫不依賴于CD8+T細(xì)胞，但依賴于CD4+T細(xì)胞。因此，作者分析了結(jié)腸中CD4+T細(xì)胞對Hhep定殖的反應(yīng)，流式結(jié)果顯示，在Hhep定殖后，CD4+ T細(xì)胞中Tfh細(xì)胞（CXCR5+PD1+CD4+ T cells）的百分比持續(xù)增加，即在結(jié)直腸腫瘤的背景下，Hhep定殖驅(qū)動Hhep特異性Tfh細(xì)胞擴(kuò)增。
圖4 Hhep定殖驅(qū)動Hhep特異性Tfh細(xì)胞擴(kuò)增
5. Tfh細(xì)胞是Hhep菌介導(dǎo)的腫瘤控制和免疫浸潤所必需的
對TLSs進(jìn)行FISH染色發(fā)現(xiàn)TLSs中含有Hhep菌和Hhep特異性T細(xì)胞。為了測試Hhep特異性Tfh細(xì)胞在TLS誘導(dǎo)和直接控制CRC中的重要性，作者利用AOM-DSS+Hhep處理Bcl6fl/flCd4Cre小鼠（Tfh 細(xì)胞缺陷型）誘導(dǎo)CRC證實(shí)了Tfh細(xì)胞是Hhep驅(qū)動的結(jié)腸TLS形成、腫瘤的免疫浸潤和控制腫瘤生長所必需的。所有數(shù)據(jù)表明，在CRC動物模型中，Hhep特異性Tfh細(xì)胞足以驅(qū)動TLS形成、增加免疫浸潤并導(dǎo)致腫瘤減少或清除。癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)庫中對CRC患者的分析表明，豐富的Tfh細(xì)胞特征通常存在于處于較低腫瘤階段的患者體內(nèi)，并且還與更長的無進(jìn)展生存期相關(guān)，因此，在小鼠和人類患者中，Tfh細(xì)胞和TLS的存在與更好地控制CRC相關(guān)。
圖5 Tfh細(xì)胞是Hhep菌介導(dǎo)的腫瘤控制和免疫浸潤所必需的
小編小結(jié)
綜上，本文利用最新的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)聯(lián)合腸道微生物測序技術(shù)，揭示了肝螺桿菌增強(qiáng)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并促使輔助T細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞的選擇性激活，小鼠結(jié)腸腫瘤縮小，延長了小鼠的生存周期。這項(xiàng)開創(chuàng)性研究為利用腸道微生物群治療（對常規(guī)藥物和免疫療法耐藥的）結(jié)直腸癌腫瘤提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。
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