編者按
腸道菌群是近年來中醫藥領域的研究熱點，不僅與中醫理論相契合，而且是中藥口服發揮藥效的重要靶點之一。基于腸道菌群的中藥藥理研究近年來也陸續刊登于核心期刊。
為了幫助廣大研究者了解中醫藥相關腸道微生物的研究進展與方法，我們收集整理了近幾年基于中藥及腸靶軸研究的發表于GUT、Nature Communications、Theranostics等高水平期刊的論文。
【中醫藥與腸道菌群專輯】為大家精細解讀重磅研究與進展。
【文獻名稱】Gut microbiota-derived inosine from dietary barley leaf supplementation attenuates colitis through PPARγ signaling activation
【雜志名】：Microbiome
【影響因子】：IF=11.607
【中藥】：大麥葉
【疾病】：結腸炎
【樣本類型】：葡聚糖硫酸鈉 (DSS) 誘導的結腸炎小鼠模型
【技術方法】：非靶向代謝組學、轉錄組、16s
【關鍵菌群】：Lactobacillus
【是否菌群驗證】：代謝物肌苷功能活性驗證
研究背景
【中藥背景】大麥葉(Barley leaf, BL)是大麥的幼草，是亞洲地區綠色功能性飲料的主要成分，也一種中草藥成分。既往研究報道了大麥葉(BL)的抗氧化特性。此外，BL對腸道功能有潛在的健康促進作用。
【疾病和腸道菌群】炎癥性腸病主要包含潰瘍性結腸炎和克羅恩病。最近的研究表明，潰瘍性結腸炎在發展中國家變得越來越頻繁，已成為全球公共衛生挑戰。潰瘍性結腸炎的病因尚不完全清楚，已有研究表明結腸上皮PPARγ表達降低是導致腸道功能障礙和慢性炎癥的重要因素。臨床上PPARγ是5-氨基水楊酸、糖皮質激素等抗炎藥物的重要靶點，然而大多以藥物為基礎的干預措施缺乏特異性，存在副作用。在腸道微生物研究方面，通過腸道微生物植物移植可以將結腸粘液層的不同性質轉移給無菌小鼠。腸易激綜合征患者的腸道菌群移植可能導致無菌小鼠腸道運動和屏障功能的改變，靶向腸道微生物群可能是預防和治療結腸炎的有效途徑。
本研究以小鼠結腸炎為模型，大麥葉(BL)顯著減輕了疾病的嚴重程度和微生物群失調。腸道微生物衍生的嘌呤代謝產物肌苷通過腺苷2A受體(A2AR)-PPARγ信號介導BL對腸道功能的有益影響。該研究為BL保護結腸炎的潛在機制提供了新的見解，并突出了BL和肌苷在預防潰瘍性結腸炎中的潛在應用。相關研究成果發表于頂級期刊《Microbiome》。
研究路線
主要研究結果
一、藥效研究：大麥葉（BL)減輕葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠結腸炎
小鼠經葡聚糖硫酸鈉 (DSS) 誘導后，上皮細胞屏障會受到化學損害，導致腸道穩態的破壞和腸道微生物群的失調。對照組飼喂標準鼠糧(CD)，BL組在標準鼠糧基礎上添加2.5%大麥葉（BL)。
(1) 表型指標變化
對照組和BL組小鼠在食物和水攝入量無差異，表明BL對飲食習慣沒有影響。BL顯著緩解DSS誘導的體重減輕、疾病指數(DAI)評分降低和結腸縮短，也顯著保護了腸道通透性(圖b-e)。
(2) 炎癥因子改變
炎癥因子是結腸炎發病的關鍵因素，BL顯著提高小鼠血清IL-4和IL-10水平，降低TNF-α水平，在結腸組織的結果與血清一致。這表明BL有效減輕DSS治療小鼠的結腸炎癥狀。
(3) 腸道菌群失調
潰瘍性結腸炎通常與腸道菌群失調有關，DSS處理誘導了腸道菌群失調(圖f)。相比DSS組，BL+DSS組的微生物群更接近于CD和BL組，這表明BL對DSS誘導的菌群失調有保護作用。BL顯著緩解DSS誘導的細菌豐度和多樣性下降(圖g)。
在門和科水平，BL顯著降低DSS誘導的Proteobacteria相對豐度增加（圖h）；DSS處理導致腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的豐度急劇增加，這是腸道菌群失調的常見特征，而補充BL能緩解上述菌群變化（圖i）。
(4) 前期預防有助于緩解DSS誘導的結腸炎
為了評估預防性或治療性環境是否有助于預防DSS誘導的結腸炎，分別在DSS治療前(beBL)或期間(duBL)小鼠補充BL。beBL治療組改善了小鼠體重減輕、DAI嚴重程度和結腸長度縮短，效果與BL組相似。同樣，結腸切片組織學分析顯示，CD+DSS組和duBL+ DSS組小鼠出現嚴重的固有層和粘膜下層的隱窩扭曲、杯狀細胞丟失和炎癥細胞浸潤，而beBL+DSS組和BL+DSS組的炎癥細胞浸潤明顯消失。綜上所述，飼糧中添加BL可預防DSS誘導的結腸炎和腸道微生物群失調。
二、功能研究：BL增強結腸蠕動，改善黏膜屏障功能
(1) 腸道形態學與結腸蠕動
BL處理組的結腸隱窩高度和肌肉層寬度顯著增加（圖a-c)，而小腸中未觀察到形態學改變。肌肉層的協調收縮可促進腸道運動，BL組小鼠大便頻率的確相應地增加，且腸道轉運時間縮短。電鏡圖像顯示，BL組表現出超形態學的顯著改變，說明BL可通過改善腸道屏障功能提升保護效應。相比之下，緊密連接蛋白和和抗菌肽表達水平并沒有差異，巨噬細胞和中性粒細胞浸潤水平也基本相當。
(2) BL對粘膜屏障功能的影響
為了進一步考察BL對粘膜屏障功能的保護作用，作者重點關注了結腸黏液層的改變。Alcian blue staining 染色顯示，BL組結腸杯狀細胞顯著增加，其粘蛋白顆粒在粘膜表面的頂端胞吐作用和分泌也增強（圖g-i）。粘蛋白2 (Muc2) 是形成粘液層的最豐富的粘蛋白，被高度糖基化并由杯狀細胞分泌。免疫組化顯示Muc2陽性的杯狀細胞明顯增多，透射電鏡分析進一步證實了上述結果。
三、信號通路研究：BL 作用依賴于PPARγ 信號通路
(1) 結腸組織基因表達譜與PPARγ 信號激活指標變化
為進一步闡明BL對小鼠腸道運動和黏膜屏障功能改善的機制，研究者進行了結腸轉錄組分析，結果顯示：BL組小鼠結腸912個基因上調，823個基因下調，PPAR信號是最顯著富集的功能通路，而富含PPAR信號的顯著改變的基因主要參與營養代謝，如脂質生物合成、降解、儲存和轉運等，這與之前研究一致。STRING分析進一步描述顯著變化基因的相互作用網絡(圖3a-d)。
定量 PCR顯示，Pparg是 BL組變化最顯著的基因（圖e)。免疫熒光成像顯示：BL組結腸組織PPARγ 蛋白表達增加（圖f）。以上表明，BL 處理導致與營養代謝相關的基因發生改變，PPARγ 信號的激活可能有助于BL對腸道功能的影響。
(2) BL調控腸道功能依賴于PPARγ 信號
為了評估PPARγ信號通路是否與改善腸道功能有關，研究用PPARγ信號拮抗劑GW9662每日灌胃給小鼠。GW9662抑制PPARγ信號通路：消除了BL對肌肉層寬度、糞便頻率、腸道蠕動（圖c-e）的改善作用；減少了產生Muc的杯狀細胞的數量；降低了結腸炎的保護作用（包括體重、DIA得分、腸道通透性、結腸長度等）(圖4g- j)；減緩了BL對DSS誘導的上皮損傷的保護作用(圖4k-l)。綜上所述，這些結果表明BL可能通過激活PPARγ信號通路來保護DSS誘導的結腸炎。
四、深入機理研究：BL促進腸道微生物群來源的嘌呤代謝物的富集
膳食營養素對微生物的代謝物的調節具有很大影響，被認為是宿主-微生物群相互作用的關鍵介質。BL影響腸功能的潛在機制可能是通過腸道微生物產生的代謝物。
(1) BL對腸道內容物和血清的代謝組影響
對BL和對照小鼠的結腸內容物和血清進行非靶向代謝組學分析, 代謝水平發生顯著變化，結腸內容物16種代謝物上調、7種下調，血清中14種代謝物上調，14種下調(圖c-d)。顯著富集通路多與葡萄糖、脂質和氨基酸代謝等能量和養分代謝相關，嘌呤代謝是最為顯著影響的途徑(圖e-f)。而參與嘌呤代謝中間代謝物肌苷和鳥苷變化也最為顯著，經體外發酵培養進行了進一步驗證。
(2) 抗生素處理驗證微生物對代謝物的直接影響
為進一步判斷腸道微生物群是否與BL喂養小鼠中肌苷和鳥苷的富集有關，進行廣譜抗生素處理，結果顯示：抗生素治療顯著降低了這兩種嘌呤代謝物的水平（圖g-h)。
(3) BL通過腸道微生物群影響結腸組織中的代謝重編程
BL通過腸道菌群影響肌苷和鳥苷的富集，可能進一步影響對腸道功能。非靶代謝組研究表明，BL組和對照組結腸組織出現明顯的代謝物聚類，顯著差異的代謝物大多與能量代謝有關，表明 BL可能通過增強糖酵解途徑促進結腸運動。抗生素處理后，BL引起的代謝改變消除。以上結果表明BL通過腸道微生物群依賴性方式誘導結腸組織中的代謝重編程。
(4) 體外驗證微生物對肌苷、鳥苷產生機制
新鮮小鼠糞便培養BL體外發酵后，肌苷和鳥苷水平顯著增加。為了闡明肌苷和鳥苷積累的機制，通過16S測定培養12h和24h的菌群組成，BL發酵組多樣性下降，表明BL發酵導致特定細菌類群的損失。BL能顯著提高Lactobacillus的豐度，且Lactobacillus的豐度與肌苷和鳥苷的濃度呈顯著正相關（R=0.89-0.93）。以上結果顯示：Lactobacillus可能有助于肌苷和鳥苷的富集。
五、體外機理驗證：肌苷激活人結腸上皮細胞中的 PPARγ 信號及功能
為驗證代謝物能夠直接影響腸上皮細胞的功能，研究者在體外評估了肌苷和鳥苷的功能活性。用肌苷處理后，細胞中 PPARγ-熒光素酶活性顯著增加，但在鳥苷處理的細胞中沒有效果（圖c-d），表明肌苷而非鳥苷可能是BL 誘導的PPARγ信號激活的代謝物。
此外， PPARγ 信號通路中關鍵基因的表達顯著增加，如脂質降解基因Lpl、脂質生物合成基因Scd1等（圖e-f）。蛋白質印跡和免疫熒光成像進一步證實肌苷添加引起的PPARγ 蛋白水平升高（圖g-i）。
進一步通過 siRNA抑制 PPARγ 表達及PPARγ敲低細胞研究，證明肌苷至少部分通過腺苷2A受體(A2AR)/ PPARγ途徑誘導粘蛋白的表達。
六、體內機理驗證：肌苷通過 A2AR/PPARγ改善腸道功能及結腸炎
(1) 腸組織PPARγ激活
肌苷處理導致結腸組織中PPARγ及其靶基因的表達顯著增加（圖a-c）。
(2) 腸道形態及腸蠕動及腸粘膜屏障功能
肌苷對腸道形態的影響與BL處理一致：結腸肌肉層寬度顯著增加（圖d-e)，進而增加排便頻率和減少腸道轉運時間來增強腸道蠕動（圖f-g)。肌苷處理增加產生粘液的杯狀細胞數，進而改善粘膜屏障功能（圖h）。反之，用 GW9662或A2AR特異性拮抗劑SCH58261處理后，肌苷未能誘導上述作用（圖e-h)。
(3) 對DSS誘導的結腸炎保護作用
肌苷減少了 DSS 誘導的體重減輕、減弱的 DAI 評分和結腸縮短（圖i-k），增強屏障功能并改善腸道通透性和組織學損傷（圖l-n）。當GW9662或SCH58261治療，肌苷對結腸炎的有益作用消失（圖i-n）。以上研究表明：肌苷對結腸炎發揮保護作用部分通過A2AR / PPARγ 信號傳導。
主要結論
大麥葉（BL）可改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的腸道微生物群失調，其對結腸炎的保護機制：通過腸道微生物產生腺苷，腺苷激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ信號通路，進而改善腸粘膜屏障等功能。此外，肌苷補充的外源性治療可產生與BL相似的結腸炎保護作用。本研究為BL對結腸炎保護作用潛在機制提供了新的見解，并論證BL和肌苷在預防潰瘍性結腸炎中的潛在應用。
該研究的整體思路非常清晰，從表型藥效到機理追溯層層遞進：藥效←功能←信號通路←活性分子→ 體外活性與機制驗證→體內活性與機制驗證。
