01

層粘連蛋白521（Laminin 521）背景

層粘連蛋白521（LN521）是天然干細胞生態位的關鍵細胞粘附蛋白，是一種用于人胚胎（hES）和誘導多能干細胞（hiPSC）培養和擴增的基質。LN521與細胞表面受體結合，激活細胞信號通路，從而產生更多功能性細胞。

Laminin 521在體外重現生物學相關的hPSC環境，促進hPSC的附著、高存活和強大的長期自我更新，是支持干細胞生長以及維持基底膜結構和性能穩定的關鍵基質蛋白。Laminin 521也是目前最常用的無滋養層培養基質之一。此外，Laminin 521無需添加任何細胞凋亡抑制劑，即可實現遺傳穩定和多能干細胞的高效單細胞傳代，細胞以均勻單細胞層生長，無需手動去除任何分化區域。另外，研究表明LN521可支持PSC生長超過10代，且無任何核型異常跡象，并且保持PSC分化為內、中、外三個胚層的能力。

02

層粘連蛋白包被實驗

01

用無菌去離子水或注射用水將層粘連蛋白521配制成400µg/ml。建議使用前用無菌1×DPBS（Ca++/Mg++）進一步稀釋至100µg/ml，然后用無菌DPBS（Ca++/Mg++）稀釋至工作濃度5-10µg/ml。包被濃度因培養細胞類型而異，建議實驗方案優化以確定細胞的最佳包被濃度。推薦濃度請見表1。

注意：

應使用含有Ca2+和Mg2+的DPBS，因為二價陽離子對蛋白質的結構和功能很重要。

Laminin 521 所需的工作濃度取決于細胞和應用。我們建議初始包被濃度為0.5μg/cm2。

表1. 不同培養容器的推薦重組人層粘連蛋白工作液的加入量

*以上體積以5μg/mL包被濃度為例

02

將指定體積的層粘連蛋白-DPBS混合物加入每個孔中，輕輕搖晃。確保整個表面都被層粘連蛋白包被溶液覆蓋，為未涂層的表面不支持細胞生長。

03

將板子放入37°C培養箱中孵育過夜，最短孵育時間為2小時，但建議過夜培養以獲得理想的細胞培養條件。注意不要讓培養容器干燥，會使LN521失活。

04

當細胞準備好接種時，吸出層粘連蛋白521溶液。

03

iPSC 培養

01

ipsc解凍（以12孔板為例）

1.1  將 iPSC 從液氮或干冰中取出 ，在 37°C水中解凍10 秒。

1.2  用75％酒精對冷凍管進行消毒，并將其轉移到工作臺面上。

1.3  將細胞轉移到一個新15 mL離心管中，離心管中含有9 mL DMEMF12。

1.4  將15 mL離心管在室溫下以300g離心5min。

1.5  將已包被好的12孔板中的層粘連蛋白溶液棄去。

1.6  棄去細胞上清液，用1 mL  mTeSR-plus（含10 µM Y-27632 ）輕輕重懸 iPSC，然后將其轉移到已包被好的12孔板中。搖動板以均勻分布細胞，最終細胞密度為1×10^5細胞/孔，靜置，室溫下放置10分鐘。確保培養在4~5天內傳代。

表2.不同培養容器的細胞接種密度，根據細胞的生長速度確定細胞數量

1.7 將12孔板放回37°C培養箱孵育。

1.8 含ROCK抑制劑的培養基應在12~16小時后除去，繼續在不含抑制劑的培養基中培養。

02

ipsc傳代方案

2.1 棄去培養上清，用1 mL PBS(Ca/Mg)沖洗。

注意：使用不含Ca2+ 和 Mg2+的PBS，因為二價陽離子對某些解離酶有負面影響。

2.2 棄去PBS，加入0.5 mL Gentle Cell Dissociation Reagent。室溫下放置6-8分鐘或放在顯微鏡下觀察，直至細胞不再結合到板上。

2.3 加入等體積的DMEM-F12，輕輕混勻細胞，在室溫轉移到離心管中，以300g離心5min。

2.4 在傳代細胞前，準備一個層粘連蛋白包被的12孔板。

2.5  棄去上清液并用含有 10  µM  Y27632  的 mTeSRplus 培養基重新懸浮細胞。

2.6 將細胞轉移到準備好的層粘連蛋白包被的12孔板中。輕輕搖動板以均勻分布細胞，并室溫下放置10至20分鐘。

2.7將12孔板放入37℃培養箱中孵育。

注意：ipsc長成單層后會迅速分化并死亡。為了保持生長和多能性，需在其長滿前進行傳代。

03

ipsc的冷凍保存

3.1 準備好溫和細胞解離試劑。
3.2 按照ipsc傳代方案進行細胞分離，使用細胞器計數，確保冷凍保存前的細胞密度。
3.3 每管細胞應以1-2×10^6細胞密度凍存。按照ipsc傳代方案中，離心、取出細胞培養基的步驟進行。將分離的iPSC沉淀重懸于適當體積的冷凍保存液中。
3.4 將1 mL 重懸的細胞冷沉淀加入1.5mL凍存管中，進行程序降溫，然后轉移到到液氮中，長期儲存。

04

層粘連蛋白包被的重要注意事項

1.實驗方案中的所有步驟均須在無菌條件下執行。
2.避免層粘連蛋白長時間暴露在室溫下。
3.應避免反復凍融
4.解凍后，未稀釋的蛋白原液在無菌條件下儲存于 2~8℃保存，可穩定保存至少3 個月。

05

相關產品信息