蛋白質(zhì)修飾之——泛素化修飾

蛋白質(zhì)的修飾有多種類型，除了常見的無機和有機小分子修飾，如磷酸化、糖基化、脂?；?，還有一類用小肽進行修飾的，例如泛素化（ubiquitination），類泛素化NEDD化（neddylation）、ISGylation蘇木化（SUMOylation）等。而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)則負責特異性地降解大多數(shù)細胞內(nèi)蛋白（約占 80% 以上），是一種高效蛋白降解途徑。泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位，調(diào)控包括細胞周期、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復以及免疫應答等在內(nèi)的多種細胞活動。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)組成

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）包括：泛素、泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3，26S蛋白酶體以及去泛素化酶。

泛素分子結(jié)構(gòu) 圖片來源：維基百科

蛋白質(zhì)泛素化降解的途徑

靶蛋白的泛素化降解是經(jīng)過幾個連續(xù)的過程來完成的，主要分為五步：

①　E1類酶激活泛素，該過程需要ATP（三磷酸腺苷）提供一定能量；

②　泛素激活酶E1將活化的泛素分子傳遞給E2類酶；

③　泛素連接酶E3將結(jié)合E2的泛素連接到靶蛋白上；

④　被標記的蛋白質(zhì)分子尾端形成一小段泛素分子鏈；

⑤　26s蛋白酶體特異性地識別這個帶有泛素標簽的底物蛋白，將其降解掉。

泛素化過程 圖解來源：維基百科

總的來說，靶蛋白是在泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的依次作用下共價連接上幾個泛素分子，最后被26s蛋白酶體特異性地識別并降解成小肽，泛素在去泛素連接酶的作用下進行回收利用，這些小肽再被細胞質(zhì)中的蛋白酶降解為氨基酸。

26S 蛋白酶體降解泛素化標記的蛋白質(zhì)

泛素-蛋白酶體途徑發(fā)現(xiàn)具有劃時代意義

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）可以控制特定蛋白質(zhì)的壽命，從而調(diào)節(jié)多種細胞功能，是生命科學領(lǐng)域重要的發(fā)現(xiàn)。由于這一發(fā)現(xiàn)2004年諾貝爾化學獎被授予以色列理工學院的亞倫·西查諾弗（Aaron Ciechanover）和阿夫拉姆·赫什科（Avram Hershko），以及美國加州大學的歐文·羅斯（Irwin Rose）三位科學家。

研究方向

◆ 細胞周期控制：細胞周期進程是由一系列細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）來進行調(diào)控的，而 CDK 則是由細胞周期蛋白（cyclin）來激活。在 CDK-cyclin 復合物行使了它的功能之后，復合物中的 cyclin 就會被多泛素化并由蛋白酶體降解，從而保證了細胞周期的正常運轉(zhuǎn)。當?shù)鞍踪|(zhì)裂解作用發(fā)生異常時，人體就會產(chǎn)生不適甚至疾病，（如子宮頸癌癥和囊腫纖維癥等）。

◆ 腫瘤藥物研究：蛋白酶抑制劑可以誘發(fā)處于快速分裂中的細胞（如癌細胞）的凋亡，因此一些蛋白酶抑制劑已經(jīng)被開發(fā)并作為化療藥品被用于治療癌癥，硼替佐米是第一種用作化學治療藥物的蛋白酶體抑制劑。主要被用于多發(fā)性骨髓瘤的治療，在治療B細胞相關(guān)癌癥的臨床前和早期臨床研究特別是一些類型的非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）有顯著效果。

◆ 調(diào)控植物生長：茁長素（auxin）或植物激素（phytohormone）的作用是調(diào)控植物生長的方向和向性，它們通過細胞信號通路來誘導一系列轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白（Aux/IAA 蛋白）進入蛋白酶體降解途徑。

◆ 細胞應激反應：當細胞應激（如感染、熱休克以及氧化損傷）反應發(fā)生時，熱休克蛋白被大量表達，其作用是識別錯誤折疊或去折疊的蛋白質(zhì)，并標記它們以供蛋白酶體降解。

◆ 晚發(fā)型神經(jīng)退行性疾病新靶點：阿爾茲海默癥（AD）、帕金森?。≒D）代表性的有 PINK1/Parkin 通路。在 PINK1/Parkin 通路中，Parkin 蛋白具有 E3 泛素連接酶活性，新的 PD 治療方法聚焦于增強線粒體泛素化或抑制去泛素化，如激活 Parkin 蛋白，或抑制去泛素化酶 USP30。

◆ 免疫系統(tǒng)中的作用：蛋白酶體被認為與炎癥反應和自身免疫性疾病相關(guān)。蛋白酶體活性水平的提高與包括牛皮癬、哮*、紅斑性狼瘡和類風濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的自身免疫性疾病相關(guān)。

如何檢測蛋白是否泛素化

1. 免疫印記、免疫沉淀

通過免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結(jié)合的蛋白分離出來（其中包括被泛素化修飾的蛋白）。分離出來的蛋白再進行SDS電泳，使用泛素抗體western blot分析。這一方法可以明確具體哪個蛋白的哪個發(fā)生了泛素化修飾?？梢猿醪脚袛嗄车鞍拙哂蟹核鼗δ埽?/span>

2. 體外泛素標記突變位點實驗

將我們要研究的蛋白（被泛素化的蛋白），通過蛋白提取試劑盒提取內(nèi)源性蛋白或者通過基因工程技術(shù)重組表達后提純。在體外與K63-orK48-linked ubiquitin chain petides一系列酶，E1,E2,E3在適合條件下孵育，然后通過western blot并用泛素化抗體進行檢測。這一方法可以明確要研究的蛋白哪個賴氨酸殘基容易發(fā)生泛素化。

3. 體外泛素化實驗

在體外反應buffer中將我們要研究的蛋白A（被泛素化的蛋白）與UBE1，Ubc13和UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及我們要研究的蛋白B（具有泛素連接酶E3活性），共同進行孵育。將孵育后的產(chǎn)物進行IP和WB分析。這一方法可以明確引起B(yǎng)蛋白是引起A蛋白發(fā)生泛素化修飾的且具有E3連接酶活性。

4. 實驗步驟

（1）反應體系配制：

準備好E3 Ubiquitin Ligase （可重組表達或從細胞裂解液中純化），Substrate (可選)不能檢測底物蛋白自泛素化。

（2）反應條件：37℃孵育 （30min-2h），建議使用 PCR 儀或金屬浴

（3）結(jié)果檢測：

取樣品 20 μL 加入 5 μL 的 5× SDS-PAGE Buffer（加入 1 μL 新鮮配制的 1M DTT），加熱樣品 95℃ 5 min，隨后使用還原性（含 DTT）上樣緩沖液進行 SDS-PAGE 電泳分析;

選擇 E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate 抗體進行 Western-blot 分析。