脂滴（liquid drops，LDs）是一種普遍存在的脂質儲存結構，LDs的異常積聚與許多疾病有關，如肥胖、心血管疾病、脂肪肝和神經退行性病變等。因此，增強LD降解可以用來治療一些相關疾病。目前利用小分子化合物（如蛋白水解靶向嵌合體PROTACs）選擇性降解致病性蛋白質已成為一種有潛力的治療策略，但對非蛋白的致病性分子如脂滴的降解一直面臨挑戰。
2021年7月8日， Cell Research（IF=25.617）雜志在線發表了題為《Degradation of lipid droplets by chimeric autophagy-tethering compounds》的研究成果，利用其課題組于2019年發表的原創ATTEC（AuTophagy-TEthering Compounds）技術，將自噬體蛋白LC3的結合分子與LD檢測探針（已知的LD特異性結合分子）連接來設計LD·ATTECs，首次實現了非蛋白類生物分子的靶向降解，完成了靶向降解技術從蛋白向非蛋白物質的突破，為藥物研發開辟了新的途徑。中科新生命提供了脂質組絕對定量技術服務。
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研究材料：
db/db小鼠肝臟組織：DMSO組、C3組、C4組、SIII組
技術方法：脂質組絕對定量、蛋白質組
實驗方法簡介：
? 步驟1：化合物設計合成與工作原理；
? 步驟2：LD·ATTECs通過自噬清除LD；
? 步驟3：體外研究：LD·ATTECs將LDs靶向自噬體而不影響整體自噬；
? 步驟4：體內藥效研究：脂質組+蛋白質組。
研究結果：
1. 化合物設計合成與工作原理
研究人員選擇GW5074（GW）和5,7-二羥基-4-苯基香豆素（DP）作為LC3結合分子，使用Sudan IV或Sudan III作為LD檢測探針（LD特異性結合分子），使用化學連接劑將LC3結合分子與LD檢測探針連接來設計LD·ATTECs。LD·ATTECs通過疏水作用與LDs或中性脂質（以TAG為典型例子）結合，同時與自噬體蛋白LC3結合，形成LD/TAG–LD·ATTEC–LC3三元復合物。該復合物被自噬體吞噬，LD/中性脂質進而自噬降解，最后由線粒體將其轉化為能量。
圖1 化合物結構及其設計/工作原理
2. LD·ATTECs通過自噬清除LD
為驗證LD·ATTECs效能，作者進行了驗證實驗。在油酸（OA）誘導6小時后，分別用LD·ATTEC1（C1）或LD·ATTEC2（C2）處理野生型（WT）小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）；24小時后發現LDs的數量和大小均呈劑量依賴性減少。而在缺乏自噬的Atg5敲除（Atg5–/–）MEFs中這些化合物的作用被消除，說明觀察到的LDs降低是自噬依賴性的。有趣的是，通過饑餓或氯化銨處理增強或抑制細胞整體自噬水平僅僅微弱改變了脂滴的水平，表明在OA誘導的模型中，選擇性靶向LDs的自噬比增強LDs降解的整體自噬更有效。進一步分析確定LD檢測探針和嵌合化合物中的LC3結合部分之間的連接對于LD降低是必需的，因為這兩部分都不能單獨誘導LD降低。
圖2 LD·ATTECs以自噬依賴的方式顯著降低LDs
3. 體外研究：LD·ATTECs將LDs靶向自噬體而不影響整體自噬
在細胞水平上，通過微尺度熱泳法（MST）測定了LD·ATTECs與重組純化的LC3B蛋白的親和力，確認LD·ATTEC–LC3相互作用需要LC3B結合“彈頭”。通過改進的ELISA分析證實了TAG–LD·ATTEC–LC3三元復合物的形成，表明合成的LD·ATTECs在體外將TAG栓系到LC3B。進一步通過共定位染色、代謝流等實驗在細胞中證實LD·ATTECs通過將LDs與LC3連接而靶向增強自噬體對LDs的吞噬，且不影響整體自噬及質膜或核膜的完整性。
圖3 LC3B-ATTEC-LD三元復合物的形成及LC3B與LD的共定位
4. 體內藥效研究：脂質組+蛋白質組
（1）LD·ATTECs減輕代謝性疾病的表型
分別在肥胖（db/db）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型上研究LD·ATTECs在體內的作用。與對照相比，兩種小鼠模型在注射兩周內引起約15%的體重減輕，脂肪/瘦肉比和肝臟重量顯著降低，小鼠肝臟和血清中的TAG、TC、FFA水平顯著降低，LD數量和大小顯著減少，證實了這些化合物在體內的作用。此外NASH小鼠肝組織間質纖維化也顯著減輕，進一步表明LD?ATTECs的潛在有益作用。
圖4 LD·ATTECs減輕db/db和NASH小鼠模型的疾病表型
（2）脂質組：LD·ATTECs顯著影響脂質水平
通過對db/db小鼠模型的肝臟樣品進行了絕對定量脂質組學分析，發現處理組肝臟總脂質濃度顯著降低，其中大多數甘油脂質、甾醇脂質和中性鞘磷脂均顯著下降，對關鍵脂質分子進行重點分析發現，具有不同碳鏈長度或飽和鍵數的TAG和ChE均被降低，而PE和PI不受影響。這表明LD·ATTECs主要靶向降解中性脂質，對極性脂質，如甘油磷脂基本不影響，這與LD·ATTECs不損害細胞膜完整性的事實一致。
圖5 LD·ATTECs顯著影響脂質水平
（3）蛋白質組：LD·ATTECs不直接干擾蛋白質水平
除脂質外，作者對小鼠的肝組織進行蛋白質組學分析，以研究LD·ATTECs在體內治療對哪些蛋白質產生影響，并觀察到LD·ATTECs治療顯著降低LD標記蛋白Plin2，但不降低SIII。脂質合成酶或脂肪酶或其輔助因子沒有發生顯著變化，自噬底物或核心通路基因也不受影響。上述結果表明LD·ATTECs基本上不直接干擾蛋白質水平，但不能完全排除對蛋白質水平的間接和連鎖效應。
總結：
本項研究以脂滴這一細胞內儲存脂肪的細胞內結構為降解目標設計ATTEC化合物（LD·ATTECs），證明了組裝拼接型ATTEC可將非蛋白類生物物質直接特異性靶向至自噬-溶酶體途徑降解，首次實現了非蛋白類物質的靶向降解技術，并在細胞和兩個獨立的肝臟脂質沉積小鼠模型中拯救了LDs相關表型，脂質組學絕對定量技術的應用從多個層面上反應了LD·ATTECs對小鼠肝組織脂質的影響。這種策略為新藥研發開拓了一條新的原創路徑。