細胞轉染實驗操作注意事項(上)
細胞轉染從開始設計到最終的檢測,大致可以由6個步驟組成:核酸準備、試劑選擇、細胞鋪板、轉染操作、細胞培養、效果檢測。每一步都會影響最終的結果,均存在不同的注意事項。

A
(1)強度合適的啟動子:在構建表達質粒的時候,有一些基因編碼出來的蛋白是對細胞有毒性的蛋白,表達會導致細胞死亡。面對這種情況需選擇較弱的啟動子或者可以誘導的啟動子限制毒性基因產物表達對細胞造成的損害。啟動子的選擇對于轉染基因的有效表達是非常重要的,對于轉染過程本身雖然無甚影響,但是對轉染結果卻有著微妙的影響。如果基因產物對細胞有毒性作用,轉染也很難進行。
(2)siRNA表達載體的使用:這種方法總體的優點在于不需要直接操作RNA,能達到較長時間的基因沉默效果。大大提高siRNA表達載體對宿主細胞的侵染性,徹底克服某些細胞轉染效率低的障礙,是實現哺乳動物細胞siRNAs瞬時表達與穩定表達的理想工具。
B
(1)質粒的形態與大小:線性化還是超螺旋會影響轉染結果,超螺旋質粒的轉染效率比線性DNA高得多,特別是瞬時轉染。質粒太大了轉染會困難一些。
(2)核酸質量對轉染效率影響非常大:一般的轉染技術基于電荷吸引原理,如果不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。
用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質,無RNA和其他化學物質的污染,應確保質粒OD值A260/A280 在1.8~2.0之間。如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白、代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。
(3)內毒素:內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分,目前用的質粒大部分是從大腸桿菌中提取出來的。內毒素通常在質粒制備的裂解中釋放出來并與質粒DNA共存,內毒素會導致轉染效率顯著下降,特別是對內毒素敏感細胞比如原代細胞、懸浮細胞和造血細胞或者想要獲得最高的轉染效率和最低的細胞毒性。
C
合適的比例搭配:對于多個質粒的共轉染,每孔DNA的總量不應超過說明書中標明的DNA量。每個質粒的比例根據質粒的大小、結構與預期的各質粒的表達水平而定。在每孔中,每個質粒至少應占總DNA量的10%以上。
現在市面上轉染試劑種類繁多,質量良莠不齊,如何選擇一款合適的轉染試劑會顯得比較棘手。在考慮合適的轉染試劑時,要考慮轉染的物質(DNA、RNA、蛋白)以及要轉染的細胞特性。
一款好的轉染試劑,要具有較高的轉染效率,較低的細胞毒性和較合適的價格。
不同細胞系轉染效率通常不同,但細胞系的選擇通常是根據實驗的需要,因此在轉染實驗前應根據實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。罕見的細胞培養,如神經元和原代細胞等通常難以轉染,在轉染試劑選擇時候更需要慎重與預期的降低。
(1)細胞狀態:健康的細胞培養物是成功轉染的基礎。最適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到指數生長期的細胞,細胞生長旺盛,最容易轉染。高的轉染效率需要一定的細胞密度,一般的轉染試劑都會有專門的說明。如為貼壁生長細胞,一般要求在轉染前一日,必須應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養皿或瓶,一般轉染時貼壁細胞密度為50%-90%,但這個需要參考所選轉染試劑的說明書,盡量在細胞最合適的生理狀態下轉染,以求最佳的轉染效果。
(2)實驗目的:不同的實驗目的也會影響轉染時的鋪板密度,比如研究細胞周期相關基因等表達周期長的基因,就需要較低的鋪板密度。
限于篇幅,本次就分享到這里,下半部分將會在后續分享。
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