編者按 2021年8月25日，來自美國Wistar研究所等研究人員在Science Advances（IF:14.136）在線發表題為" A cancer ubiquitome landscape identifies metabolic reprogramming as target of Parkin tumor suppression"的研究成果。該研究通過蛋白質組學和泛素化修飾組篩選，發現了通用腫瘤抑制機制：E3泛素連接酶Parkin，可以作為腫瘤抑制途徑的關鍵以及應激激活效應物，通過干擾癌細胞重新編程其代謝的能力來拮抗惡性細胞增殖和轉移能力。 【研究材料】 PC3、LN229、MCF10A等多種癌細胞、癌組織 【技術方法】 蛋白組學、泛素化修飾蛋白組學、免疫組化、western blot等 【方法流程】 1. Parkin不影響癌細胞中的線粒體自噬 將Parkin在前列腺癌PC3細胞中過表達，未引起線粒體外膜蛋白的丟失（圖1A），也未引起線粒體質量的改變（圖1B）。溶酶體LAMP1蛋白與線粒體自噬時的標志蛋白TOMM20的共定位也未受PC3的影響（圖1C和圖1D），線粒體結構和活性也均未受影響（圖1E和圖1F）。 圖1 Parkin不影響癌細胞中的線粒體自噬 2. Parkin抑制腫瘤細胞的運動和侵襲 Parkin在惡性膠質瘤LN229細胞中過表達減少了黏合斑的面積（圖2A）、長度（圖2B）及其組裝和解體（圖2C），抑制了腫瘤的細胞運動（圖2D和圖2E）。傷口閉合實驗中顯示Parkin抑制了細胞的定向遷移（圖2F），多種癌細胞的侵襲也被Parkin阻斷（圖2G）。 圖2 Parkin抑制腫瘤細胞的運動和侵襲 3. Parkin抑制原發性腫瘤和轉移性腫瘤的生長 為了驗證Parkin在腫瘤生長中的作用，作者進行了體內實驗。將Parkin過表達的PC3細胞皮下接種至NOD-SCID免疫缺陷小鼠中，發現Parkin抑制了腫瘤的肺轉移（圖3A-3C），將PC3細胞直接接種至脾臟，結果發現Parkin也抑制了腫瘤轉移至肝臟（圖3D和3E）。組織芯片實驗也證實腫瘤病人組織中的Parkin表達量較正常組織中少。 圖3 Parkin抑制原發性腫瘤和轉移性腫瘤的生長 4. Parkin抑制腫瘤細胞運動是通過其E3連接酶活性實現的 對Parkin進行點突變（S65A或C431S），使其失去E3連接酶活性，轉染入前列腺癌PC3細胞中發現Parkin丟失了抑制腫瘤細胞的運動和侵襲的能力（圖4A-4D）。 圖4 Parkin抑制腫瘤細胞運動是通過其E3連接酶活性實現的 5. Parkin在癌癥中的功能分子分析 為驗證Parkin在癌癥中的具體作用，作者開展了蛋白組學和泛素化修飾蛋白組學。蛋白組學實驗中共鑒定到5557個蛋白，對顯著性差異蛋白（Parkin過表達vs Vector）的生信分析發現Parkin影響了細胞運動通路、抑制了MAPK信號通路、下調了癌基因信號通路等通路（圖5A-5D）。5557個總鑒定蛋白中的741個蛋白屬于線粒體蛋白，該部分蛋白參與的呼吸鏈復合體（MTND1等）、內源性抗氧化、蛋白翻譯等多個通路中的多個蛋白均受Parkin影響（圖5E和5F）。 圖5 蛋白組學和泛素化修飾蛋白組學結果 泛素化修飾組學結果中，受Parkin顯著調控的泛素化蛋白主要參與了細胞死亡（如HK1蛋白）、線粒體動態變化(如MFN2、RHOT1等蛋白)、非氧化的磷酸戊糖途徑(如TKT、TALDO1蛋白)等信號通路（圖6A）。 Western blot實驗驗證了Parkin下游蛋白MFN2和TKT的泛素化水平(圖6B和6C)以及Parkin對MFN2、TKT蛋白的降解和對FAK、Src的磷酸化（細胞運動所需）水平的下調（圖6D和6H），且自噬抑制劑BafA不影響Parkin對MFN2和TKT的降解（圖6E）。 圖6 泛素化修飾蛋白組學結果及驗證 6. Parkin通過調節線粒體的動態變化從而抑制腫瘤的運動 泛素化修飾蛋白組學結果中顯示MFN2和RHOT1參與了線粒體動態變化信號通路，Parkin通過降解MFN2和RHOT1，從而抑制了線粒體的動態變化，在過表達Parkin的細胞中過表達MFN2則恢復了線粒體的動態變化、線粒體的融合和裂變及線粒體運動。RHOT1的過表達也發揮了與MFN2相同的作用（圖7A-7F）。RHOT1點突變實驗驗證了Parkin是通過特異性調節線粒體的動態變化從而抑制腫瘤運動的（圖7G和7H）。 圖7 Parkin通過調節線粒體的動態變化抑制腫瘤運動 7. Parkin通過調節磷酸戊糖信號通路影響氧化應激從而調控腫瘤細胞的運動 泛素化修飾蛋白組學結果顯示Parkin靶向了磷酸戊糖途徑（PPP），作者隨即驗證了該信號通路對腫瘤的影響。Parkin抑制了磷酸戊糖途徑中的TKT的活性（圖8A），這導致了PPP通量的減少（圖8B和8C）。Parkin還抑制了葡萄糖的攝入和乳酸的形成，最終導致了細胞饑餓。Parkin對TKT的抑制還降低了NADPH的水平、提高了線粒體活性氧（ROS）的增加（圖8D-8F），由此產生的氧化應激可以抑制線粒體運輸和腫瘤細胞運動。在Parkin過表達細胞中過表達TKT恢復了線粒體的運動（圖8I）、TKT的siRNA沉默抑制了腫瘤的侵襲（圖8K）以及TKT K499R的突變而未被Parkin降解進而促進了細胞遷移，上述均證明了PPP在Parkin抑制腫瘤細胞運動中的特異性。 小結 中科優品推薦 基于新一代離子淌度質譜平臺，4D-修飾產品實現檢測性能全面突破： ?? 高深度——鑒定深度提升超20%~100%，挖掘更多生物信息 ?? 更微量——樣本用量降低2/3，為珍貴、微量分析節省樣本 ?? 更精準——精準定位相近修飾位點，提高后續位點驗證概率 ?? 更可靠——金標抗體富集修飾肽段，操作可靠有保障
腫瘤作為人類健康的"頭號殺手"，通過重組細胞代謝適應不利微環境從而促進疾病的發展。Parkin是一種E3泛素連接酶，它可能在調節癌細胞代謝和抑制腫瘤生長方面發揮作用，但具體作用機制仍不清楚。
研究結果
圖8 Parkin通過調節磷酸戊糖信號通路調控氧化應激從而調控腫瘤細胞的運動
在這項研究中，作者證明了Parkin靶向糖酵解和線粒體網絡來拮抗腫瘤生長。該途徑獨立于線粒體損傷或線粒體自噬激活，需要Parkin E3連接酶活性來降解線粒體動力學效應物(MFN2和RHOT1)和PPP的非氧化階段(TKT)。這造成了急性代謝和氧化應激，抑制亞細胞線粒體運輸，抑制細胞運動激酶、FAK和Src的磷酸化，并阻止腫瘤細胞運動，從而極大地抑制體內原發和轉移性腫瘤的生長。
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Sci Adv (IF 14.136)|腫瘤“一網打盡”! 泛素化修飾組揭示廣譜抑制腫瘤生長的新機制
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-23T19:30 (訪問量:4593)
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