代謝組學(xué)是一個(gè)高度跨學(xué)科的領(lǐng)域，它系統(tǒng)地研究了一個(gè)或多個(gè)生物系統(tǒng)（即細(xì)胞、組織、器官、生物流體或生物體）中的代謝物譜。作為系統(tǒng)生物學(xué)的方法的一部分，代謝組學(xué)可以提高我們對復(fù)雜細(xì)胞途徑和生物機(jī)制的理解。氣相或液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜(GC-MS或LC-MS)和核磁共振(NMR)光譜是科學(xué)研究中最常用的代謝分析平臺。其中，氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）由于其具有穩(wěn)健性、優(yōu)異的分離能力、選擇性、靈敏度和再現(xiàn)性等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用在植物、醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境、天然產(chǎn)物化學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域。
GC-MS技術(shù)主要特點(diǎn)
GC-MS除了上述提到的檢測優(yōu)勢外，還有一些特色，比如：
衍生化
與LC-MS不同，GC-MS一般需要將代謝提取物衍生為揮發(fā)性和熱穩(wěn)定的衍生物，操作相對繁瑣，但是也避免了LC-MS檢測常見問題如基質(zhì)效應(yīng)和共洗脫化合物的離子抑制，從而實(shí)現(xiàn)了更高的色譜分辨率。
離子源
GC–MS中使用的兩種主要電離形式是電子轟擊電離（EI）和化學(xué)電離（CI）。目前，基于GC-MS的代謝組學(xué)研究中絕大多數(shù)都使用EI源，主要是基于EI的GC–MS有成熟完善的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，從而使其成為較好方法。
檢測物質(zhì)范圍
GC–MS主要用于分離和鑒定低分子量（約50–600 Da）和揮發(fā)性化合物。對于極性、不耐熱、非揮發(fā)性代謝物的檢測，需要在分析之前進(jìn)行化學(xué)衍生。
數(shù)據(jù)庫
具有成熟商業(yè)化的公共數(shù)據(jù)庫NIST和Fiehn數(shù)據(jù)庫。
GC-MS實(shí)驗(yàn)流程主要包括樣本前處理、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)處理和分析等步驟。
樣本前處理
任何獲得的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集的質(zhì)量都會受到樣本制備方法的高度影響。由于代謝組非常復(fù)雜，含有數(shù)千種在化學(xué)多樣性、極性、分子量、濃度方面高度可變的代謝產(chǎn)物，因此通常需要進(jìn)行預(yù)濃縮步驟比如固相萃取（SPE）、固相微萃取（SPME）、液-液萃取等步驟。應(yīng)用化學(xué)試劑（溶劑）裂解細(xì)胞以提取細(xì)胞內(nèi)代謝物是代謝組學(xué)研究中流行的方法之一，在選擇溶劑和提取條件時(shí)，應(yīng)考慮分析的細(xì)胞類型和感興趣的代謝物類別。
揮發(fā)性代謝物
揮發(fā)性代謝物在性質(zhì)上極其多樣化，普遍存在于包括植物，動物和微生物在內(nèi)的不同類型的樣品中。例如，許多植物在生長發(fā)育過程中釋放不同類型的揮發(fā)性代謝物，作為抵御害蟲的防御機(jī)制，也作為傳粉媒介的引誘劑。雖然揮發(fā)性代謝物也是不同食品和飲料產(chǎn)品的風(fēng)味和香氣的重要組成部分，但它們也有可能成為人類呼吸中許多疾病(如肺癌等)的候選生物標(biāo)志物。目前，已有大量的研究采用GC-MS技術(shù)來檢測揮發(fā)性代謝物。在揮發(fā)性代謝物研究中，多以頂空固相微萃取（HS-SPME）的方式進(jìn)行樣本前處理，對目標(biāo)物進(jìn)行萃取和富集，以達(dá)到分離和提純的目的。
非揮發(fā)性代謝物(衍生化方法)
基于GC–MS的代謝組學(xué)檢測的先決條件是極性化合物的衍生化，以降低分析物的極性并增加熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性。羧酸（-COOH）、醇（-OH）、胺（-NH2）和硫醇（-SH）等物質(zhì)中的分子官能團(tuán)中的活性氫可以通過烷基化、酰化或甲GUI烷基化衍生。三甲基GUI烷化（TMS）試劑通常是使用最多的衍生化試劑，因?yàn)樗鼈儗衔镱悇e的全面覆蓋和相對易用性，其中（MSTFA）和N，O-雙（三甲基甲GUI烷基）乙酰胺（BSA）被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用范圍的通用試劑，并且具有相當(dāng)?shù)腉UI烷化能力。目前N，O-雙（三甲基甲GUI烷基）（BSTFA）在代謝組學(xué)研究中越來越受歡迎，并且與其他常用的甲GUI烷基化試劑（如BSA、MSA和MSTFA）相比，其產(chǎn)生的副產(chǎn)物更少 。在某些情況下，三甲基硅氯GUI烷(TMCS)以1%或10%的濃度作為催化劑加入到GUI烷化反應(yīng)中。此時(shí)，TMCS被用來提高M(jìn)STFA和BSTFA的反應(yīng)活性(即增加TMS供體的潛力)，并有助于仲醇和胺的衍生化。此外，吡啶作為一種無水溶劑，經(jīng)常用于制備代謝提取物進(jìn)行GC分析，因?yàn)樗梢宰鳛樗崆宄齽铀傺苌磻?yīng)，而不需要長時(shí)間提高衍生化溫度。在衍生化過程中一般采用兩步法，先使用甲氧胺鹽衍生，保護(hù)酮酸和糖的羰基部分，再進(jìn)行甲GUI烷化衍生。
GC–MS分析
質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的重要組成部分，通過測量帶電離子形式存在的分子的質(zhì)荷比（m/z），從而區(qū)分不同的質(zhì)量峰。GC-MS應(yīng)用中最常用的質(zhì)量分析器是飛行時(shí)間（TOF）和四極桿，前者具有高質(zhì)量分辨率、高質(zhì)量精度和非常快的掃描速度，解析更多離子，主要用于非靶向檢測，并擴(kuò)大GC–MS代謝組學(xué)應(yīng)用范圍；后者具有高靈敏度和良好的動態(tài)范圍等優(yōu)勢，用于關(guān)注物質(zhì)的靶向檢測。
多維色譜(氣體或液體)涉及耦合兩個(gè)色譜柱，具有正交的保留機(jī)制(例如極性和非極性)，并在兩個(gè)色譜柱上運(yùn)行樣品。多維氣相色譜(MDGC)是最常用的2DGC方法，其中只有從第一柱(維度)中選擇的部分洗脫液被轉(zhuǎn)移到第二柱。相比之下，全二維氣相色譜法(GC × GC)涉及將來自主柱的洗脫液的每個(gè)部分都轉(zhuǎn)移到次級柱，在到達(dá)檢測器之前，它經(jīng)過進(jìn)一步的分離步驟。然后，每種方法的結(jié)果數(shù)據(jù)都可以繪制在2D或3D空間中。該系統(tǒng)的總峰值容量在理論上是每個(gè)維度的峰值容量和由此產(chǎn)生的分離空間的乘積，通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過標(biāo)準(zhǔn)1D系統(tǒng)的峰值容量，并增加了儀器動態(tài)范圍。
數(shù)據(jù)處理和分析
原始數(shù)據(jù)使用分析軟件如ChromaTOF進(jìn)行基線去噪和平滑、峰提取、解卷積、峰對齊等處理。通過與數(shù)據(jù)庫中代謝物的保留指數(shù)和碎片離子譜圖匹配進(jìn)行化合物鑒定，接下來對數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟，然后才能進(jìn)行有意義的統(tǒng)計(jì)分析，如缺失值的補(bǔ)充，歸一化處理等。進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，包括單變量統(tǒng)計(jì)分析、多維統(tǒng)計(jì)分析、差異代謝物篩選、差異代謝物相關(guān)性分析、KEGG通路分析等內(nèi)容進(jìn)一步挖掘潛在的差異和機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：doi: 10.1007/s11306-018-1449-2
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