編者按
當前，世界上每年約生產31億條輪胎，N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基對苯二胺(6PPD)因其優異的抗臭氧性能被廣泛用于輪胎橡膠添加劑，當輪胎與路面摩擦時，輪胎磨損顆粒極易氧化分解為具有致畸和致突變的強毒性污染物——6PPD-醌(6PPDQ) 。6PPD及其氧化產物6PPD-醌表現出不同的急性毒性和生物蓄積性。
今天，我們分享由中國科學院生態環境研究中心研究團隊發表在Environmental Science & Technology（IF=10.8）的一項最新研究成果。該研究通過細胞實驗、斑馬魚實驗等比較了輪胎添加劑6PPD及其轉化產物6PPD-醌 (6PPDQ)對甲狀腺的干擾作用，首次明確揭示了6PPD與6PPD-醌在斑馬魚視覺毒性上存在顯著差異，并闡明了6PPD誘導眼損傷的具體分子通路，強調了在輪胎相關污染物中，6PPD而非6PPD-醌通過干擾甲狀腺信號通路來損害水生生物視覺系統的重要風險物質，有助于未來對環境殘留的監測與風險評估。
實驗結果顯示，盡管6PPD和6PPD-醌顯示出與甲狀腺激素受體 (TR) 亞型相似的結合親和力及對GH3細胞的抑制作用，但僅在暴露于6PPD之后，斑馬魚的甲狀腺信號通路、視覺發育、趨光行為及視網膜層的細胞密度才受到顯著影響。進一步研究表明，6PPD可作為TR拮抗劑，降低視蛋白豐度并抑制視錐細胞增殖，最終改變斑馬魚視網膜層結構并導致斑馬魚小眼畸形。尤其當暴露在環境相關濃度下，6PPD 誘導了TRβ、opn1lw1、opn1mw1、rpe65a、nr2e3等基因表達的改變，但并未觀察到明顯的眼組織病理學變化。本研究首次闡明與6PPD-醌相比，6PPD對視覺系統的損傷更為嚴重，甲狀腺信號通路的干擾是其中一個因素，而其他重要的毒性靶點仍需進一步研究。
文章題目
6PPD, Not 6PPD-Quinone, Induced Serious Zebrafish Eye Damage by Disrupting the Thyroid Signaling Pathway
雜志：Environmental Science & Technology（IF=10.8）
發表時間：2024年12月4日
作者：常靜、王會利、萬斌等
單位：中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室等
01、研究亮點
• 首次揭示輪胎添加劑6PPD及其轉化物6PPD-醌 (6PPDQ) 在斑馬魚視覺毒性上存在顯著差異，證實了6PPD是導致嚴重眼損傷，如小眼畸形、視網膜結構破壞、視覺功能障礙的主要物質，而6PPD-醌在相同條件下未觀察到類似的眼損傷效應；
• 闡明了6PPD誘導眼損傷的分子通路，表明6PPD作為甲狀腺激素受體β (TRβ) 的拮抗劑，干擾甲狀腺信號通路；
• 采用斑馬魚、細胞實驗等方法，系統驗證了6PPD的甲狀腺干擾活性和眼毒性機制。
摘要
02、研究背景
N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基對苯二胺(6PPD)因其優異的抗臭氧性能而被廣泛用于輪胎橡膠添加劑。6PPD在歐洲各國的年產量約為1000-15000噸，在中國的年產量約為200000噸。6PPD可能通過生產、橡膠工業使用及橡膠產品的使用與處置等釋放到環境中，并可以在污水處理廠、道路徑流和輪胎磨損顆粒浸出液中被檢測到，最終流入城市河流。
通過分析14種不同輪胎的洗脫液發現，中性水中的6PPD濃度范圍為10-100μg/L；在拜耳布倫斯比特爾工廠 (Bayer Brunsbittel) ，其污水處理時6PPD的最大濃度達到0.24mg/L；在珠江三角洲地區，沉積物中6PPD的濃度為0.585-468 ng/g，地表徑流中為0.19–7.52ng/L。6PPD-醌 (6PPDQ) 作為6PPD的關鍵毒性轉化產物，在環境中比其前體物6PPD更穩定、更持久。在河流中檢測到的6PPD-醌的濃度明顯高于6PPD，道路徑流和雨水中6PPD-醌的濃度范圍為0.3-19.0μg/L。
6PPD和6PPD-醌在水系統中普遍存在，并對水生生物構成潛在威脅。如，6PPD對我國特有的一種小型魚類——稀有鮈鯽具有高毒性，而6PPD-醌對虹鱒有劇毒，也是道路徑流中導致銀鮭死亡的主要有毒物質。有一項研究評估了6PPD在斑馬魚中的內分泌毒性，表明6PPD通過降低三碘甲腺原氨酸 (T3) 水平并增加甲狀腺素 (T4) 水平，從而導致甲狀腺功能失調。
我們之前的研究表明，輪胎磨損顆粒 (TWP) 浸出液中的甲狀腺干擾性物質可誘導斑馬魚眼損傷。然而，TWP浸出液中損害斑馬魚視覺功能的關鍵污染物尚不清楚。因此，研究人員假設6PPD和6PPD-醌可能作為甲狀腺干擾性物質，是TWP浸出液中誘導斑馬魚小眼畸形的潛在污染物。
甲狀腺激素水平可調控視網膜中的視錐細胞亞型。甲狀腺激素受體β（TRβ）和T3模擬長波(L)和中波(M)的視錐細胞，并抑制短波(S)視錐細胞，而甲狀腺激素受體α（TRα）則誘導視錐細胞中紫外線視蛋白到藍色視蛋白的可逆、時間依賴性轉換。甲狀激素和甲狀腺激素受體調節視蛋白合成，對光感受器細胞的增殖至關重要。光感受器細胞的一個重要功能是將光信號轉化為膜信號，從而調節視覺功能。魚類的視覺感知對躲避捕食者和覓食行為至關重要。
盡管之前已提出6PPD對甲狀腺激素水平具有干擾作用，但6PPD誘導的甲狀腺功能減退是否引起視覺損傷尚不明確。此外，6PPD的轉化產物6PPD-醌對銀鮭表現出比6PPD更高的急性毒性。在本研究中，研究人員假設6PPD或6PPD-醌可能通過干擾甲狀腺信號通路誘導視覺損傷。
斑馬魚及其胚胎，是研究甲狀腺干擾物的重要水生模式生物。斑馬魚在受精后 72小時 (hpf) 開始產生T4，120hpf時其甲狀腺濾泡完全形成。它們通體透明，便于觀察化學暴露后的生理變化，且由于其基因與哺乳動物相似，在斑馬魚胚胎中觀察到的許多毒性效應與在哺乳動物中觀察到的毒性效應相一致，因此，斑馬魚被廣泛用于測試化學物質的甲狀腺毒性。體外實驗，包括T-screen實驗及模擬分子對接，可通過化合物與蛋白質受體的結合，來揭示化學物質對甲狀腺信號通路的潛在影響。
本研究中，研究人員首先通過計算機模擬與體外實驗確定了6PPD和6PPD-醌對甲狀腺的干擾作用。通過對斑馬魚進行表型分析、甲狀腺激素測量和基因表達分析，進一步證實了6PPD和6PPD-醌干擾甲狀腺信號通路。通過分析眼組織病理學、光傳導通路相關基因和蛋白表達水平，揭示了6PPD暴露后甲狀腺干擾誘導的眼損傷。本研究不僅揭示了6PPD和6PPD-醌在斑馬魚中的不同毒性效應，還預測了6PPD在引起斑馬魚眼損傷的不良通路 (AOP)。
03、研究結果
1. 6PPD、6PPD-醌與甲狀腺受體(TR)異構體的結合
先前的研究表明，6PPD是一種潛在的甲狀腺信號干擾物，可以改變甲狀腺激素水平并影響HPT軸相關基因表達。干擾甲狀腺激素信號通路的關鍵是結合甲狀腺激素受體 (TR)。本研究中，研究人員首先評估了6PPD和6PPD-醌與兩種TR異構體——TRα、TRβ的結合活性。
與天然配體T3相比，TRA1、6PPD和6PPD-醌都能適用于TRα或TRβ活性，但結合效率低于T3。在T3、TRA1、6PPD和6PPD-醌與TRα、TRβ的復合物中分別觀察到6個、10共同的結合殘基，6PPD-醌與TRα的相互作用又與MET262、SER280形成了兩個氫鍵。而對于TRβ，6PPD-醌也表現出比6PPD更高的結合親和力，但均低于T3 ，6PPD和6PPD-醌與TRβ的結合親和力比TRA1高1.3–1.4 倍，在T3、6PPD和6PPD-醌與TRβ的復合物中觀察到1個共同的氫鍵 (MET238)。這些結果表明， 6PPD和6PPD-醌與甲狀腺受體(TR)有很強的相互作用，且可能通過與TR的相互作用來干擾甲狀腺受體活性。
圖1
2. 6PPD和6PPD-醌對GH3細胞增殖的影響
為了確定6PPD和6PPD-醌在細胞水平上的TR信號通路活性，研究人員進一步研究了它們對GH3細胞增殖的影響。M T3暴露顯著增加了GH3細胞增殖，而在缺乏T3之下，6PPD或6PPD-醌暴露后的GH3細胞增殖則沒有顯著差異。這表明，6PPD和6PPD-醌不是TR激動劑。
已知的TR拮抗劑TRA1顯著抑制了T3觸發的GH3細胞增殖，抑制率為 24–48%，這表明了有效的拮抗反應。在拮抗實驗中，隨著6PPD濃度的增加，反應呈下降趨勢，而6PPD-醌和TRA1暴露后的濃度反應則是非線性的。TRA1和6PPD-醌的異常濃度反應可能源于GH3細胞中復雜的分子。GH3細胞有TRs、甲狀腺過氧化物酶和脫碘酶等許多酶，其增殖對T3水平很敏感。TRA1和6PPD-醌可能不僅與TR結合，還會影響脫碘酶的活性。
GH3細胞中的增殖效果反映了這些效應的綜合作用，導致觀察到的非線性濃度反應。類似的濃度-反應模式在先前的研究中也有出現。總之，與TRA1相比，6PPD 和6PPD-醌可能是潛在的甲狀腺系統拮抗劑，電子模擬和體外實驗都揭示了6PPD和 6PPD-醌對甲狀腺激素信號的潛在干擾作用。
圖2
3. 斑馬魚揭示6PPD和6PPD-醌的急性毒性及其不良后果
體外實驗表明6PPD和6PPD-醌是潛在的甲狀腺干擾物。斑馬魚的甲狀腺內分泌系統可以調節斑馬魚胚胎的發育、生長和代謝等。為了通過斑馬魚實驗進一步驗證 6PPD和6PPD-醌的甲狀腺干擾效應，研究人員選擇斑馬魚胚胎作為理想模型，發現暴露于6PPD120h的斑馬魚胚胎半數致死濃度（LC50）為0.87mg/L，而暴露于濃度為10mg/L的6PPD-醌后未觀察到顯著的死亡率。
盡管6PPD-醌在銀鮭中表現出非常高的急性毒性 (LC50為95ng/L)，但暴露于6PPD-醌的斑馬魚急性毒性較低。因此，6PPD-醌的急性毒性呈現出物種特異性。鑒于暴露于6PPD比6PPD-醌的急性毒性高，因此要更加關注6PPD在斑馬魚中的毒性效應。
發育毒性分析結果顯示，眼徑與體長的比值隨暴露濃度的增加而減小，且在暴露于0.1、0.2、0.4和0.8mg/L的6PPD中顯著 (p<0.05) 減小。魚鰾未擴張率也隨濃度依賴性增加，且在0.2、0.4和0.8mg/L的6PPD暴露組中顯著 (p<0.05) 增加。72h的孵化率僅在6PPD的高濃度暴露組 (>1.6mg/L) 中顯著降低 (p<0.05)。
先前的急性毒性研究也表明，小眼和魚鰾未擴張是暴露于6PPD后的兩個主要的不良后果。眼睛和魚鰾的形態和功能變化被用于評估魚類甲狀腺干擾物效應，這些表型的改變可能間接表明6PPD對HPT軸的潛在干擾。與對照組相比，6PPD-醌的暴露組的眼睛大小、孵化率和體長沒有顯著變化，但斑馬魚腸道中觀察到褐色沉淀物。僅在2.0mg/L的6PPD-醌暴露組魚鰾未擴張率顯著增加（p<0.05)，斑馬魚腸道免疫系統受到6PPD-醌暴露的干擾，導致腸道明顯擴大。
然而，研究人員并不認為褐色沉淀物是由血液凝固的腸道引起的。由于腸道中的顏色與6PPD-醌粉末的顏色相似，研究人員推測褐色沉淀物表明6PPD-醌在腸道中具有生物積累性。最近的研究也支持此推測，即6PPD-醌更易于在成年斑馬魚腸道中積累。斑馬魚魚鰾的擴張取決于連接腸道和魚鰾腔氣管。
考慮到未改變的體長、正常的眼睛大小及明顯的腸道損傷等，魚鰾未擴張率的增加可能與腸道病變相關，而非甲狀腺系統的破壞。6PPD和6PPD-醌明顯的表型差異表明，在亞致死濃度下，斑馬魚胚胎是由6PPD而非6PPD-醌作為甲狀腺系統干擾物。
圖3
4. 趨光行為異常僅在暴露于6PPD中觀察到
隨后，研究人員通過趨光行為實驗進一步鑒定了眼睛的視覺損傷。在0.4mg/L的6PPD暴露組中，趨光行為被顯著抑制 (p<0.05)，而在6PPD-醌暴露組未觀察到顯著的變化（圖3E,F）。這些結果證實了6PPD而非6PPD-醌影響了斑馬魚胚胎的視覺功能。
5. 6PPD而非6PPD-醌干擾了斑馬魚甲狀腺系統
盡管體外實驗表明6PPD和6PPD-醌都干擾了甲狀腺激素受體信號通路，但斑馬魚胚胎暴露于6PPD-醌后未觀察到明顯的甲狀腺干擾相關表型變化。因此，通過斑馬魚實驗進一步證實了6PPD和6PPD-醌的甲狀腺系統干擾效應。
研究人員首先在亞致死濃度下測量了對照組、陽性對照組 (TRA1)、6PPD和 6PPD-醌暴露組中的T3、T4等甲狀腺激素水平。所有暴露組的T3水平均無顯著增加，而T4水平隨著6PPD暴露濃度的增加而增加。暴露于0.1和0.4mg/L的6PPD后，T4水平分別增加了14.7%和47.3%。陽性對照組TRA1暴露也誘導了T4水平增加了25.8%，這與6PPD暴露結果一致。而6PPD-醌暴露對T3和T4水平均沒有顯著影響。斑馬魚實驗結果進一步證實，6PPD而非6PPD-醌破壞了斑馬魚的甲狀腺系統。
為了進一步比較6PPD和6PPD-醌的甲狀腺系統干擾機制，研究人員還對HPT 軸相關基因進行了定量分析，結果顯示，基因轉錄水平隨著6PPD暴露濃度的增加而增加。6PPD暴露后，tra、dio2、dio3和tpo基因的表達水平呈濃度依賴性增加，是甲狀腺功能紊亂效應的重要生物標志物。與這些結果一致，TRA1、TR拮抗劑也顯著上調了斑馬魚中tra、dio2基因的表達。可以預測，6PPD是一種潛在的TR拮抗劑。HPT軸相關基因的上調和T4水平的增加似乎是對TR活性抑制的負反饋效應。
此外，主要調節甲狀腺激素合成的nis和tpo基因在6PPD暴露后也表現出顯著的變化。6PPD可能不僅作為TR拮抗劑來抑制TR活性，還會中斷甲狀腺激素合成過程。因此，通過斑馬魚實驗進一步證明了6PPD是一種甲狀腺信號干擾物，而TR拮抗作用可能不是6PPD唯一的甲狀腺干擾作用因素，6PPD的其他毒性靶點仍需進一步研究。暴露于6PPD-醌后，HPT軸相關基因的表達水平沒有顯著差異，這也與未改變的甲狀腺激素水平一致。這些結果進一步證明6PPD-醌基本未對斑馬魚的甲狀腺系統造成影響。
圖4
6. 斑馬魚揭示6PPD而非6PPD-醌暴露誘導斑馬魚眼組織病理學損傷
作為一種潛在的甲狀腺系統干擾物，最嚴重的不良后果之一是眼睛形態和功能的改變。因此，在暴露于6PPD或6PPD-醌后進行了斑馬魚眼組織病理學分析發現，暴露于0.4mg/L的6PPD后，視網膜神經節細胞層 (GCL)中的細胞密度顯著增加了 22.1%（p<0.05）；暴露于6PPD后，視網膜內核層 (INL)中的細胞密度沒有顯著變化；在視網膜外核層 (ONL) 中，細胞密度呈濃度依賴性下降，在低、中、高濃度的 6PPD組中分別下降了 28.5%、31.7% 和 51.9%。在0.1和0.4mg/L的6PPD暴露組中，ONL中的細胞密度均顯著降低 (p<0.05)。
光感受器細胞主要位于視網膜的視網膜色素上皮 (RPE) 和ONL中，因此，暴露于6PPD后，尤其是在0.1和0.4mg/L的濃度下，感光細胞的數量可能會顯著減少。在斑馬魚視網膜發育過程中，最早出現的視網膜細胞是GCL中的神經節細胞。減少的神經節細胞可以誘導祖細胞增加，從而調節光感受器細胞的分化。在本研究中，高濃度的6PPD暴露后，GCL中細胞密度的增加可能表明祖細胞增殖受到了抑制，最終導致視網膜ONL中光感受器細胞的細胞密度降低。
暴露于0.4mg/L的6PPD后，晶狀體直徑也顯著減小，這可能導致眼睛變小。相比之下，暴露于高濃度的6PPD-醌后，晶狀體直徑、GCL、INL和ONL中的細胞密度沒有顯著的變化。眼組織病理學結果表明，暴露于6PPD而非6PPD-醌嚴重損害了斑馬魚的視網膜和晶狀體，從而影響了眼睛發育。
圖5
7. 斑馬魚揭示暴露于6PPD后光轉導功能受到破壞
本研究中，6PPD處理后ONL中光感受器細胞密度的降低可能進一步影響光轉導功能。為了研究6PPD和TRA1暴露后的分子調控機制，研究人員對光轉導通路中的基因表達和蛋白質水平進行了定量分析，結果表明，視蛋白基因表達的顯著下降與視網膜INL中光感受器細胞密度的降低一致，這是暴露于6PPD或TRA1后的關鍵事件。相比之下，暴露于6PPD-醌后，未發現光轉導相關基因存在濃度依賴性改變。
本研究還定量分析了TRA1或6PPD組中OPN1LW2、OPN1SW1、OPN1SW2、OPN1MW2 和GNAT2的相對蛋白豐度，結果顯示：6PPD暴露顯著下調光轉導通路關鍵基因，特別是S-視錐細胞視蛋白基因opn1sw1, opn1sw2及其下游基因rho, pde6gb, gnat2。蛋白水平驗證顯示，OPN1SW1, OPN1SW2, OPN1LW2 和 GNAT2 蛋白豐度顯著降低。TR 拮抗劑TRA1暴露也引起類似基因表達下調模式。
圖6
8. 暴露于6PPD后斑馬魚視覺功能受損與甲狀腺激素信號破壞相關
暴露于6PPD對斑馬魚胚胎的存活率和發育異常有顯著的影響。本研究中，TR 拮抗劑 TRA1或6PPD暴露導致S-視錐細胞視蛋白豐度顯著降低，OPN1SW1視蛋白的豐度與trα 和dio3基因表達高度相關（p<0.05）。因此，6PPD可能作為TR拮抗劑誘導眼損傷。
為了進一步證實這一假設，研究人員將已知的TR激動劑T3與6PPD共暴露，觀察對眼睛發育的恢復效果。結果表明，T3與6PPD共暴露部分逆轉了6PPD引起的眼睛尺寸減小、ONL 細胞密度降低、晶狀體直徑減小及部分光轉導基因opn1mw2, opn1sw2, pde6gb的下調，支持甲狀腺信號通路的核心作用。
總之，6PPD作為TRβ拮抗劑，會干擾甲狀腺信號，特異性抑制S-視錐細胞視蛋白 OPN1SW)的合成，進而抑制視錐細胞增殖，最終導致視網膜結構破壞、晶狀體發育受損、小眼畸形和視覺功能喪失等。
圖7
04、編者點評
本研究首次揭示了輪胎添加劑6PPD與其轉化產物6PPD-醌 (6PPDQ) 在斑馬魚視覺毒性上存在的顯著差異，并通過斑馬魚實驗、體外實驗等強調了暴露于6PPD后甲狀腺信號紊亂與視覺感知功能障礙之間的關系。
6PPD作為甲狀腺激素受體β (TRβ)的拮抗劑，會干擾甲狀腺信號通路，導致下丘腦-垂體-甲狀腺 (HPT) 軸相關基因 trβ, tra, dio2, tpo 等表達顯著上調，以及甲狀腺激素水平改變等。6PPD作為一種新興的污染物，其在環境相關濃度下對分子通路的干擾已構成風險，建議加強對水體中6PPD殘留的監管及風險評估。
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