AAT Bioquest新型鈣離子熒光探針Calbryte 520, AM是一種高性能的熒光染料，廣泛應用于活細胞鈣離子（Ca²?）動態變化的實時監測。以下是其應用領域及核心優勢的詳細分析：
一、主要應用領域
活細胞鈣成像
神經元活動研究：監測動作電位或神經遞質釋放觸發的鈣瞬變，適用于腦片或原代神經元。
心肌細胞研究：分析心肌收縮過程中的鈣振蕩及信號傳導。
免疫細胞激活：檢測T細胞、巨噬細胞等免疫應答時的鈣信號。
高通量篩選
用于藥物開發中靶向鈣通道或GPCR受體的化合物篩選（如拮抗劑/激動劑效應評估）。
多參數熒光聯用
兼容GFP/RFP等熒光蛋白或其他探針（如線粒體染料），支持多色成像。
長期動態追蹤
適用于數小時的長時間鈣信號記錄（如晝夜節律相關研究）。
二、核心優勢
卓越的光穩定性與信噪比
相比傳統探針（如Fluo-4），Calbryte 520的熒光強度更高，光漂白速率更低，適合長時間或高分辨率成像（如共聚焦、雙光子顯微鏡）。
更高的鈣親和力與靈敏度
Kd ~320 nM，在低鈣濃度下仍能清晰響應，可檢測微小的鈣波動（如亞細胞器鈣釋放）。
優異的細胞滲透性與負載效率
乙酰氧甲酯（AM）形式：無需顯微注射，溫和穿透細胞膜，且胞內酯酶水解效率高，適合難轉染細胞（如原代細胞、干細胞）。
低細胞毒性
長時間孵育（如>2小時）對細胞活性影響較小，減少實驗干擾。
兼容性廣泛
激發/發射波長（Ex/Em: 490/520 nm）適配常規FITC濾光片系統，與流式細胞儀、微孔板讀數儀等設備匹配。
pH不敏感性
在生理pH范圍內（6.5-8.0）熒光信號穩定，避免因代謝酸化導致的假陽性。
三、使用注意事項
負載條件優化：建議使用含Pluronic F-127的緩沖液（如HBSS）增強疏水性AM酯的溶解性。
校準建議：需結合鈣離子載體（如ionomycin）和EGTA進行原位校準，以定量絕對鈣濃度。
多色實驗設計：需注意與其他探針的光譜重疊（如綠色通道），建議通過線性 unmixing 校正。
四、對比傳統探針(如Fluo-4, Rhod-2)
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特性 |
Calbryte520, AM |
Fluo-4, AM |
Rhod-2, AM |
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Kd (nM) |
~320 |
~345 |
~570 |
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信噪比 |
高 |
中等 |
較低(紅色通道) |
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光穩定性 |
★★★★★ |
★★★☆☆ |
★★★★☆ |
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胞內滯留性 |
優（低泄漏） |
中等 |
易泄漏 |
Calbryte 520, AM憑借其高靈敏度、低毒性及廣泛的兼容性，成為復雜鈣信號研究（如神經科學、藥理學）的理想工具，尤其在需要長時間或高時空分辨率成像的實驗設計中優勢顯著。
圖示：
Calbryte 520 AM（# 20653）和 Fluo-4, AM（# 20550）在 CHO-K1 細胞中測量了 ATP 反應。CHO-K1 細胞以每孔 50,000 個細胞/100 µl的密度在 96 孔黑色壁/透明底 Costar 板中過夜培養。向孔中加入 100 µl 10 µg/ml Calbryte 520 AM 或 10 µg/ml Fluo-4， AM 的 HH 緩沖液，在 37°C 下孵育 45 分鐘。移除兩種染料加載溶液，每孔加入 200 µl HH 緩沖液。每孔加入 50 µl ATP，以達到最終濃度為 10 µM。在 Keyence 顯微鏡的 FITC 通道中獲取圖像。
通過激光掃描共聚焦顯微鏡分析了細胞內游離鈣離子的分布情況。細胞內游離鈣離子通過紅色熒光探針Rhod-2 AM（#21060）進行檢測。細胞核用 DAPI（藍色）染色。攜帶 eGFP 報告基因的 pEZ-LV203 載體產生綠色熒光蛋白。