AAT Bioquest新型鈣離子熒光探針Calbryte 520, AM是一種高性能的熒光染料，廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞鈣離子（Ca²?）動(dòng)態(tài)變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測。以下是其應(yīng)用領(lǐng)域及核心優(yōu)勢(shì)的詳細(xì)分析：
一、主要應(yīng)用領(lǐng)域
活細(xì)胞鈣成像
神經(jīng)元活動(dòng)研究：監(jiān)測動(dòng)作電位或神經(jīng)遞質(zhì)釋放觸發(fā)的鈣瞬變，適用于腦片或原代神經(jīng)元。
心肌細(xì)胞研究：分析心肌收縮過程中的鈣振蕩及信號(hào)傳導(dǎo)。
免疫細(xì)胞激活：檢測T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫應(yīng)答時(shí)的鈣信號(hào)。
高通量篩選
用于藥物開發(fā)中靶向鈣通道或GPCR受體的化合物篩選（如拮抗劑/激動(dòng)劑效應(yīng)評(píng)估）。
多參數(shù)熒光聯(lián)用
兼容GFP/RFP等熒光蛋白或其他探針（如線粒體染料），支持多色成像。
長期動(dòng)態(tài)追蹤
適用于數(shù)小時(shí)的長時(shí)間鈣信號(hào)記錄（如晝夜節(jié)律相關(guān)研究）。
二、核心優(yōu)勢(shì)
卓越的光穩(wěn)定性與信噪比
相比傳統(tǒng)探針（如Fluo-4），Calbryte 520的熒光強(qiáng)度更高，光漂白速率更低，適合長時(shí)間或高分辨率成像（如共聚焦、雙光子顯微鏡）。
更高的鈣親和力與靈敏度
Kd ~320 nM，在低鈣濃度下仍能清晰響應(yīng)，可檢測微小的鈣波動(dòng)（如亞細(xì)胞器鈣釋放）。
優(yōu)異的細(xì)胞滲透性與負(fù)載效率
乙酰氧甲酯（AM）形式：無需顯微注射，溫和穿透細(xì)胞膜，且胞內(nèi)酯酶水解效率高，適合難轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞）。
低細(xì)胞毒性
長時(shí)間孵育（如>2小時(shí)）對(duì)細(xì)胞活性影響較小，減少實(shí)驗(yàn)干擾。
兼容性廣泛
激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em: 490/520 nm）適配常規(guī)FITC濾光片系統(tǒng)，與流式細(xì)胞儀、微孔板讀數(shù)儀等設(shè)備匹配。
pH不敏感性
在生理pH范圍內(nèi)（6.5-8.0）熒光信號(hào)穩(wěn)定，避免因代謝酸化導(dǎo)致的假陽性。
三、使用注意事項(xiàng)
負(fù)載條件優(yōu)化：建議使用含Pluronic F-127的緩沖液（如HBSS）增強(qiáng)疏水性AM酯的溶解性。
校準(zhǔn)建議：需結(jié)合鈣離子載體（如ionomycin）和EGTA進(jìn)行原位校準(zhǔn)，以定量絕對(duì)鈣濃度。
多色實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：需注意與其他探針的光譜重疊（如綠色通道），建議通過線性 unmixing 校正。
四、對(duì)比傳統(tǒng)探針(如Fluo-4, Rhod-2)
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特性 |
Calbryte520, AM |
Fluo-4, AM |
Rhod-2, AM |
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Kd (nM) |
~320 |
~345 |
~570 |
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信噪比 |
高 |
中等 |
較低(紅色通道) |
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光穩(wěn)定性 |
★★★★★ |
★★★☆☆ |
★★★★☆ |
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胞內(nèi)滯留性 |
優(yōu)（低泄漏） |
中等 |
易泄漏 |
Calbryte 520, AM憑借其高靈敏度、低毒性及廣泛的兼容性，成為復(fù)雜鈣信號(hào)研究（如神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)）的理想工具，尤其在需要長時(shí)間或高時(shí)空分辨率成像的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中優(yōu)勢(shì)顯著。
圖示：
Calbryte 520 AM（# 20653）和 Fluo-4, AM（# 20550）在 CHO-K1 細(xì)胞中測量了 ATP 反應(yīng)。CHO-K1 細(xì)胞以每孔 50,000 個(gè)細(xì)胞/100 µl的密度在 96 孔黑色壁/透明底 Costar 板中過夜培養(yǎng)。向孔中加入 100 µl 10 µg/ml Calbryte 520 AM 或 10 µg/ml Fluo-4， AM 的 HH 緩沖液，在 37°C 下孵育 45 分鐘。移除兩種染料加載溶液，每孔加入 200 µl HH 緩沖液。每孔加入 50 µl ATP，以達(dá)到最終濃度為 10 µM。在 Keyence 顯微鏡的 FITC 通道中獲取圖像。
通過激光掃描共聚焦顯微鏡分析了細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的分布情況。細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子通過紅色熒光探針Rhod-2 AM（#21060）進(jìn)行檢測。細(xì)胞核用 DAPI（藍(lán)色）染色。攜帶 eGFP 報(bào)告基因的 pEZ-LV203 載體產(chǎn)生綠色熒光蛋白。