Topo克隆系列專題
——簡單、快速、高效的克隆策略
關鍵詞：Topo克隆?? 載體?? 連接反應?? TA克隆?? blunt載體? zero載體
Topo克隆技術是通過TOPO載體上偶聯的異構酶(Topoisomerase)實現插入片段的快速克隆。不同于傳統的TA克隆，Topo克隆技術能夠在2-5min內快速完成插入片段和載體的連接反應，操作簡單，連接效率極高，克隆陽性率接近100%。
背景
傳統的TA克隆對于PCR產物的要求較高，而且連接反應時間很長，同時陽性率低，而且自連率很高，無形中會成倍地增加科研者寶貴的時間。翊圣生物推出Hieff CloneTM TOPO系列克隆載體，能夠快速而且高效地得到目的重組載體。Hieff CloneTM Zero TOPO載體為零背景載體，載體骨架中含有**ccdB基因。此克隆方法無需藍白斑篩選，陽性率100%。
Hieff CloneTM Zero TOPO Simple系列載體，不含多克隆酶切位點（MCS）使用者在引入后續酶切位點進行酶切操作時，不會受到載體MCS位點的影響，從而增加了克隆成功率。
TOPO克隆原理
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Topo載體兩端通過磷酸鍵偶聯Topo酶，連接反應時，受插入片段的5’端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5’端羥基與載體片段3’端磷酸基團連接在一起，Topo異構酶從載體分子上脫落，完成連接反應。 |
零背景載體：Hieff CloneTM Zero Topo載體骨架中含有ccdB致死基因。當載體發生自連時，ccdB基因完整，會表達ccdB毒素蛋白，導致細菌死亡；當插入片段成功連接時，ccdB基因不完整，ccdB基因不能完整表達，細菌存活。 |
TOPO克隆與傳統TA克隆方法的比較
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? |
反應時間 |
反應溫度 |
體系組成 |
克隆陽性率 |
PCR產物 |
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Zero TOPO |
2-5min |
室溫 |
載體+插入片段 |
★★★★★ |
Blunt載體無需加“A” |
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傳統TA克隆 |
過夜 |
16℃ |
載體+插入片段+T4連接酶 |
★★ |
需要加“A” |
產品特點
快速：僅需2-5分鐘即可完成連接反應
高效：無自連現象，陽性克隆率100%
簡便：只需加入目的片段即可
操作流程
產品實例
連接效率高，克隆陽性率極高
圖1：Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit可有效克隆1-5kb基因，成功率100%。A-C：TOPO克隆轉化平板。D-F：插入片段PCR鑒定電泳圖。
同類產品比較：
圖2：相同體系下，克隆3kb目的基因，Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit較同類產品具有高連接效率。
FAQ
Q1：從質粒上酶切的產物可直接連接Topo載體嗎？為什么？
A：Topo載體進行連接反應的時候需要5`羥基端和Topo酶發生反應。PCR產物5`羥基端沒有磷酸化，可以直接進行TOPO克隆。但是，酶切產物5`端為磷酸化狀態，可以直接進行TA克隆的，但是不能進行Topo克隆。如果需要，可以用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）進行去磷酸化處理后連接Topo載體。
Q2：連接反應體系和反應時間以及溫度對連接效率的影響大嗎？
A：建議反應體系應控制在10μl內，體系太小連接會受到影響。如果目的基因濃度太低，建議濃縮之后再連接，以提高連接成功率。插入片段使用量參考說明書。一般1-2min即可完成連接反應，若想得到更多克隆，可適當延長至5min，但不能超過5min。室溫反應即可。
Q3：如何選擇合適的載體？
A：若PCR產物為Taq酶擴增則選擇TOPO-TA克隆載體系列，若PCR產物為高保真酶擴增則選擇Blunt載體系列，。Simple載體不含多克隆位點區，可根據客戶需求在PCR擴增時添加自己需要的酶切位點。
Q4：若是儲存了很久的PCR產物還能用來做克隆嗎？
A：建議采用新鮮的PCR產物會使連接效率更高一些，若是-20℃保存的一周內還可以使用。請避免PCR產物的反復凍融和降解。
Q5：PCR擴增產物需要純化嗎？
A：先對PCR產物跑膠鑒定，若是PCR產物電泳條帶單一、濃度較高且無引物二聚體可直接進行連接反應。若是有雜帶或引物二聚體建議純化之后再進行連接反應。
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