2023年1月，德國科學家對膠質瘤石蠟樣本（FFPE）進行蛋白質組學檢測及分子分型，并與WHO分型及基于其他組學的分子分型進行了比較?；诘鞍踪|組學的數據，研究者特別發現了IDH突變膠質瘤的兩個獨特亞群，并對這兩個亞群進行了分子特征分析。研究成果以“Proteomics separates adult-type diffuse high-grade gliomas in metabolic subgroups independent of 1p/19q codeletion and across IDH mutational status”為題，發表在Cell Reports Medicine（IF:16.988 ）上。
研究結果
1.?蛋白質組學實驗設計及基礎結果分析
成人型彌漫性膠質瘤分類包括星形細胞瘤、異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變型、少突神經膠質瘤、IDH突變和1p/19q共缺失型、膠質母細胞瘤以及IDH野生型膠質瘤。研究者共收集了4個不同類型的共計42個膠質瘤腦組織FFPE樣本進行基于質譜的蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學檢測，分別是11個IDH野生型膠質瘤（IDHwt）樣本、11個IDH突變和1p/19q共缺失型（codel）、10個IDH突變和非1p/19q缺失型（non-codel）以及10個非腫瘤的中樞神經系統組織（CNS ctrl）作為對照。
聚類分析以及PCA分析顯示對照組CNS ctrl樣本緊密聚集且與其他膠質瘤樣本有明顯區分，這表明腫瘤組織中發生了明顯的蛋白質組學層面上的改變。CNS ctrl樣本富集在突觸和髓鞘質相關蛋白，這和CPTAC數據庫膠質瘤蛋白組的結果相一致。在本次研究中，IDHwt組和CNS ctrl最不一樣，也與IDHmut有差別。IDHwt蛋白質組富集了和炎癥、MCM復合體DNA多聚酶、一種整合素/膠原蛋白、層粘連蛋白富集的“基質膜樣”細胞外基質（ECM）的蛋白譜，缺少透明質酸。
IDHwt比IDHmut的差異蛋白與CPTAC數據庫結果一致，且在很大程度上不受本次數據中1p/19q共缺失狀態的影響。與IDHwt 膠質瘤更“侵襲性”的表型一致，許多IDHwt中高豐度的異常蛋白是癌癥驅動因子，其中一些與侵襲有關。與IDHmut相關的異常蛋白包括IDHmut下調的腫瘤抑制蛋白。
有趣的是，在聚類分析和PCA分析的前兩個主成分中，IDHmut膠質瘤并沒有因為1p/19q共缺失狀態的不同而分類，這表明共缺失狀態對蛋白質組的影響很小。相反，IDHmut膠質瘤可分為兩個不同的聚類，這兩個聚類的共缺失狀態和患者性別無明顯差異。研究者將它們稱為HGG-IDHmut-A和HGG-IDHmut-B。HGG-IDHmut-A形成了一個亞群，與其他膠質瘤相比，它更類似于CNS ctrl。HGG-IDHmut-B形成更彌散的亞群，與IDHwt膠質瘤最相關。
2.?HGG-IDHmut-A/B亞分層獨立于表觀遺傳譜、CNV變化和臨床特征
研究者進一步分析了HGG-IDHmut-A和HGG-IDHmut-B的表觀遺傳特征、拷貝數變異（CNV）改變及其他特征。分析發現A、B這兩個分類在表觀遺傳特征、CNV改變、CDHK2A/B狀態和EGFR擴增等方面上無明顯差異，也和其他臨床特征如WHO分級、年齡、性別、總腫瘤細胞含量及無疾病進展生存期等不相關。與1p/19q狀態相一致，1p/19q共缺失的樣本中有降低的來自1p/19q編碼的蛋白。
3.?HGG-IDHmut-A/B蛋白質組學間的差異分析
（1）HGG-IDHmut-A/B間的差異反映了染色體和線粒體異常
研究者對42個樣本檢測的蛋白基因的染色體定位分布進行了分析，發現蛋白基因較平均地分布在整個基因組。隨后研究者對每個樣本中由來源自同一條染色體臂的基因編碼的蛋白質進行合并（定義為染色體臂特異性蛋白質組），使用這個染色體臂特異性蛋白質組進行42個樣本的聚類分析，結果與直接的蛋白質組學的聚類結果相似。HGG-IDHmut-A/B樣本顯示了不同的染色體臂特異性蛋白質組，HGG-IDHmut-B樣本中由線粒體DNA（mtDNA）編碼的蛋白表達水平更低。這個趨勢在核基因組編碼的線粒體呼吸鏈復合體蛋白中也很明顯，但不是線粒體核糖體蛋白。1p/19q共缺失狀態則并未表現出這些線粒體異常。
（2）HGG-IDHmut-A/B分層與腫瘤驅動基因的差異表達相關
HGG-IDHmut-A/B間還存在腫瘤驅動因子的差異改變。在HGG-IDHmut-B中最顯著富集的腫瘤驅動因子是CCAR1。研究者的數據中，與CCAR1相關性最高的蛋白是剪切因子SRSF1，它的相關蛋白SRSF5通過在高葡萄糖條件下CCAR1的可變剪接促進肺癌進展。本次數據中，SRSF5是隨機分布在樣本中的，而SRSF1、2、3、4、6、7、10和11相對于HGG-IDHmut-A顯著富集在HGG-IDHmut-B樣本中。
4.?1p/19q共缺失狀態影響腫瘤相關蛋白
HGG-IDHmut-A/B間的差異蛋白約有1900個，而1p/19q共缺失和非缺失的樣本間的差異蛋白僅約100個，其中一些蛋白質被報道與多種腫瘤相關。此外，研究者還發現，在膠質瘤中1p/19編碼蛋白的變化較其他常見染色體改變（gain of chr. 7 及 loss of chr. 10）引起的蛋白變化要微弱。
5.?HGG-IDHmut-A/B分層與不同的代謝譜相關
HGG-IDHmut-A和-B之間線粒體呼吸鏈蛋白豐度的差異促使研究者更詳細地研究代謝改變。呼吸鏈復合體和三羧酸(TCA)循環蛋白在IDHwt和HGG-IDHmut-B中含量較低。有趣的是，呼吸鏈復合體I (在HGG-IDHmut-B表達最低)的輕度功能障礙可通過活性氧(ROS)的產生促進癌癥。值得注意的是，IDH1是HGG-IDHmut-B中唯-一豐度輕度升高的TCA蛋白。相反，TCA蛋白羥戊二酸德氫化酶L（OGDHL）在HGG-IDHmut-B中顯著降低，這可能與其腫瘤抑制功能有關。
在糖酵解方面，HGG-IDHmut-B再次表現出與IDHwt相似的蛋白質和蛋白磷酸化特征，特別是己糖激酶1在HGG-IDHmut和IDHwt中含量較低。在多種人類癌細胞系中，下調己糖激酶1促進糖酵解，而在異種移植模型中則能增強腫瘤惡性。同樣，與HGG-IDHmut-A相比，IDHwt和HGG- IDHmut-B中線粒體ATP酶抑制劑ATPIF1上S39位點的磷酸化豐度降低。研究表明，ATPIF1過表達促進結腸癌中從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉變，而ATPIF1活性可被S39磷酸化抑制。
因此，HGG-IDHmut-B顯示出糖酵解活性增加的分子特征，HGG-IDHmut-A顯示出氧化磷酸化增加的分子特征，與1p/19q共缺失無關。
6.?基于蛋白質組學的亞分層與腫瘤抑制因子和驅動因子的相關性比1p/19q共缺失更好
接下來研究者分析了在膠質瘤腫瘤抑制因子和癌蛋白的情況?；谶@些蛋白，PCA分析能將IDHwt、HGG-IDHmut-A和HGG-IDHmut-B進行分離，但無法分離出1p/19q共缺失與非缺失狀態。HGG-IDHmut-B特征與IDHwt更相似。一些腫瘤抑制因子在IDHwt中特異性下調，另一些僅在HGG-IDHmut-B中下調，還有一些兩者都下調。IDHwt和HGG-IDHmut-B樣本中存在RAS通路蛋白的下調，這與之前的報道一致。相反，IDHwt和HGG-IDHmut-B樣本中有幾個原癌基因的升高。此外，還發現，HGG-IDHmut-B和HGG-IDHmut-A表現出強烈的腫瘤抑制因子和癌蛋白磷酸化含量的變化，且與1p/19q共缺失狀態無關。例如，與HGG- IDHmut-A相比，周期蛋白依賴性激酶CDK11B上的T595磷酸化在HGG- IDHmut-B和IDHwt中顯著升高，這意味著CDK11B活性升高，與細胞周期進程相關。這些結果表明，HGG- IDHmut-A和HGG- IDHmut-B間的信號差異對癌癥至關重要。
7.?HGG-IDHmut-A/B間的差異在各類研究中是明顯的
為了驗證以上分析得到的獨立于1p/19q狀態的IDHmut膠質瘤代謝分層的主要分子特征，研究者分析了三個最近發表的蛋白質組學數據集。這三個數據集的結果與研究者本次的結果高度一致，參與糖酵解、TCA循環、氧化磷酸化的蛋白，甚至全局的調控蛋白都與研究者本次的結果有很好的一致性。其中，參與TCA循環的蛋白在各研究中表現出最高的一致性。
與多組學數據集相比較，本研究的HGG-IDHmut-A(高水平氧化磷酸化)膠質瘤亞組對應于Proneural-like (nmf1)亞組。本研究的HGG-IDHmut-B(低水平氧化磷酸化)亞組與經典樣(nmf3)膠質瘤亞組相關性最強，但也與間質樣(nmf2)亞組有一定的相關性。除了代謝變化外，其他生物途徑，如mRNA剪接、RNA代謝、翻譯、染色質動力學、DNA復制和富含膠原蛋白的ECM，這些在HGG-IDHmut-B和相對應的類似亞組中富集。相反，神經表型和線粒體蛋白在HGG-IDHmut-A /Proneural-like中富集。此外，在HGG-IDHmut-B富集的前幾個異常蛋白和可能的癌癥驅動因子如CCAR1、YBX1和ERH在其他數據集中同樣受到調控。
總體，研究者的結果表明IDHmut膠質瘤可以分為兩種蛋白質組學亞型，它們具有不同的能量代謝，總體上比1p/19q共缺失引起的差異更大。這種基于蛋白質組學上發現的IDHmut的兩種差異不僅獨立于1p/19q，而且適用于其他IDHmut狀態(即可在其他數據集中得到驗證)。
研究總結
研究者對來自IDH野生型(IDHwt)膠質瘤、IDH突變型(IDHmut)膠質瘤、有或無1p/19q共缺失以及非腫瘤對照的共計42個石蠟樣本(FFPE)樣本進行了基于質譜的蛋白質組學表征，共定量檢測了超過5500個蛋白和5000個磷酸化位點。基于蛋白質表達變化的結果分析顯示，膠質瘤通過IDH1/2突變狀態分離，而不是通過1p/19q狀態分離。相反，IDHmut膠質瘤分裂為兩種蛋白質組亞型，每個亞型都有廣泛的蛋白質擾動，包括參與有氧/無氧能量代謝的蛋白。使用三個獨立的膠質瘤蛋白質組數據集進行的驗證證實了這兩個亞型的存在，并將IDHmut亞型與IDHwt膠質瘤中已建立的Proneural-like 和經典/間充質亞型聯系起來。總體，研究者利用蛋白質組學發現了不同于常見的基于1p/19q共缺失有無來區分IDHmut的亞型分類，這種分類在未來或將通過提供蛋白質組/代謝指導的治療使IDHmut膠質瘤患者受益。
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