作者：北極星

肺癌是全世界癌癥相關疾病死亡的主要原因，每年造成170多萬人死亡，5年存活率中位數為19 %。大多數肺癌患者患有肺腺癌，其5年生存率約為10%。肺腺癌較容易發生于女性及不抽煙者，發病年齡較小，女性相對多見。

多數肺腺癌起源于較小的支氣管，為周圍型肺癌。早期一般沒有明顯的臨床癥狀，往往在胸部 X 線檢查時被發現。由于肺癌早期發現困難，局部復發和遠處轉移風險高，預后差。因此，搞清楚肺腺癌的分子機理及開發有效的肺癌治療方法是當務之急。

在人類肺癌中，STK11、PTEN、TP53和KRAS是最常見的突變基因，通過cBioPortal對肺癌基因進行數據分析。

分析結果顯示在1144例肺癌樣本(其中660例為腺癌，484例為鱗狀細胞癌)中，tp53在肺癌的不同亞型中均發生突變，這表明該通路的改變對肺癌的形成至關重要。

STK11和PTEN的突變分析顯示，STK11的缺失主要見于腺癌，而PTEN的缺失主要見于SCC(圖1)。對KRAS的分析顯示，在腺癌中伴隨著STK11的缺失。相比之下，SCC中的KRAS突變沒有與STK11或PTEN突變同時發生(圖1，表1)。這些分析表明，mTOR通路的兩個關鍵調控因子STK11和PTEN在肺癌生物學中具有不同的功能。

圖1. stk11、PTEN、KRAS和trp53在人類肺癌中的突變譜

在人類肺癌中，STK11、PTEN、TP53和KRAS是最常見的突變基因，基因工程小鼠模型(GEMM)是分析肺癌中癌癥相關基因功能的關鍵。

本研究以這幾個基因為研究對象，利用CRISPR/Cas9構建小鼠肺腺癌模型(圖2a)，比較Stk11和Pten在結合Trp53缺失和Kras功能獲得的肺癌中的作用。小鼠接種含有SKT的AAV病毒(圖2c)， 10周后檢查肺。石蠟切片證實轉基因小鼠的肺異常和Cas9/GFP表達激活。

Stk11的缺失加速了肺腫瘤的進展（如圖3）。用含有sgRNA的AAV病毒接種小鼠后，通過PET/MRI掃描成像對腫瘤體積進行量化(圖3A,B)，SKT誘導的腫瘤體積迅速增大。相反，Pten (PKT)誘導的腫瘤體積增長速度較慢，且沒有達到與SKT腫瘤相似的體積(圖3B)。在Stk11缺陷腫瘤中，腫瘤體積的增加也導致了生存率的降低。

SKT誘導腫瘤的中位總生存期為4個月，PKT腫瘤小鼠的中位總生存期為6個月，而注射AAV-YFP對照病毒的小鼠在6個月期間沒有發生肺腫瘤(圖3C)。顯微鏡檢查發現Stk11 (SKT)突變誘導的腫瘤數目少但體積很大，PKT突變誘導了多個腫瘤，但這些腫瘤通常較小(圖3D)。這些分析表明Skt11是控制肺腺癌的重要抑癌因子，Pten的影響是次要的。

圖3. Stk11的缺失加速了肺腫瘤的進展

通過對腫瘤樣本進行了分析，揭示Stk11缺失對腫瘤增殖的影響。在Stk11腫瘤中，抗Stk11抗體染色呈陰性，Erk通路在KRASG12D陽性腫瘤中被激活；Akt通路在Pten突變腫瘤中被激活，大約一半PKT誘導的腫瘤沒有p-Akt染色陽性 (圖4b)。腫瘤體積的增加通常與增殖改變有關，用細胞增殖標記物Ki67進行樣本染色。

與含有Pten、Trp53和Kras引導物的病毒啟動的腫瘤相比，Stk11陰性的腫瘤Ki67陽性細胞大約增加了兩倍。而PKT樣本中的Ki67陽性細胞與僅由Trp53和Kras突變啟動的腫瘤相似。這表明Pten的缺失并不影響該亞型肺腫瘤的增殖能力(圖4c)。Western blot分析證實腫瘤樣本中Erk激活，部分PKT樣本中p-Akt升高(圖4d)。這些數據表明，Stk11的缺失與Trp53和Kras的改變共同促進了增殖，而Pten的缺失不影響腫瘤增殖。

圖4.Stk11的缺失會增加增殖從而推動腫瘤進展

在本研究證明了Stk11的缺失通過增加增殖和Trp53的缺失及Kras的激活而促進肺腺癌的發生。通過應用CRISPR/Cas9技術生成體內癌癥模型，這使人們能夠評估個體基因在癌癥形成中的功能。肺腺癌STK11突變結合KRAS功能增加和TP53缺失在人類樣本中很常見，這證實了CRISPR/Cas9癌癥模型反映了人類癌癥的機理。

CRISPR/Cas9技術給生命科學領域帶來了巨大沖擊,CRISPR/Cas9相關研究成果頻頻登上Cell、Nature、Science等期刊,被譽為“基因編輯 高分文章必備”，也更是拿到了2020的諾貝爾化學獎。